甘露聚糖酶對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能、消化代謝和非特異性免疫力的影響

毛述宏 林 鑫 楊 陽(yáng) 林仕梅* 羅 琳 李斌斌

(1.西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716;2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716;3.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

羅非魚是我國(guó)南方的主養(yǎng)經(jīng)濟(jì)魚類。由于動(dòng)物蛋白質(zhì)資源短缺、價(jià)格昂貴，加之養(yǎng)殖羅非魚的市場(chǎng)價(jià)格低迷，所以養(yǎng)殖者在羅非魚飼料中大量使用植物蛋白質(zhì)源以控制飼料成本。眾所周知，植物蛋白質(zhì)源中含有大量的非淀粉多糖(NSP)抗?fàn)I養(yǎng)因子，如甘露聚糖，它會(huì)影響動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用［1－2］。目前，飼料生產(chǎn)實(shí)踐中主要通過(guò)添加外源性NSP酶或生物發(fā)酵以減輕或消除飼料中NSP的抗?fàn)I養(yǎng)作用［3－4］。甘露聚糖酶作為一種NSP酶，不僅能改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能［5－6］，還能 提 高 動(dòng) 物 的 免 疫 能 力［7－8］，且 已 在 畜［9］、禽［10－11］飼料中廣泛應(yīng)用。而有關(guān)甘露聚糖酶在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以吉富羅非魚(GIFT，Oreochromis niloticus)為試驗(yàn)對(duì)象，在實(shí)用配方的基礎(chǔ)上，從生長(zhǎng)性能、消化代謝和非特異性免疫力等方面去比較和評(píng)價(jià)甘露聚糖酶的作用效果，以期為甘露聚糖酶在水產(chǎn)飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以豆粕、菜籽粕和棉籽粕為主要蛋白質(zhì)源，以米糠、豆油和亞麻籽油為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料(表1)，在此基礎(chǔ)上分別添加 0(對(duì)照)、500和1 000 U/kg甘露聚糖酶(活性9 000 U/g，最適催化溫度65℃，最適催化pH 6.0)配制成3種等氮(粗蛋白質(zhì)水平為 33.5%)等能(總能為15.7 MJ/kg)的試驗(yàn)飼料。各飼料原料粉碎過(guò)60目篩，采取逐級(jí)稀釋法混合均勻，制成粒徑為2.5 mm的硬顆粒飼料，風(fēng)干后放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚選用當(dāng)年培育的體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的雄性吉富羅非魚［平均體重為(5.80±0.01)g］270尾，隨機(jī)分成3組(每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾)，隨機(jī)飼喂1種試驗(yàn)飼料，在室內(nèi)淡水循環(huán)水族缸(有效體積為300 L)中飼養(yǎng)8周，日投飼率為體重的3% ～5%，每天08:00、12:30、17:00各投喂1次。水源為曝氣自來(lái)水，試驗(yàn)期間水溫為(27.8 ±2.2)℃，pH 為 7.4 ±0.4，溶解氧 ＞6.5 mg/L，氨 氮 ＜ 0.50 mg/L，亞 硝 酸 鹽 氮 ＜0.06 mg/L。

1.3 樣品制備與分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h后稱重并計(jì)數(shù)。每缸隨機(jī)取5尾魚于尾靜脈取血，將一部分血液樣品保存在醫(yī)用真空采血管中，用于血液細(xì)胞分析和血液生化分析;其余血液樣品置4℃冰箱過(guò)夜，于4℃條件下以6 000 r/min離心10 min，收集血清，－20℃保存?zhèn)溆?。每缸另隨機(jī)取3尾魚，取出腸道(全腸)，立即放入液氮罐中速凍，然后轉(zhuǎn)入－80℃低溫冰箱保存。腸道勻漿液在10 000×g、4℃條件下離心30 min，取上清液作為酶活性分析樣品，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(邁瑞，BC－5180)檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)總數(shù)及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比。

采用全自動(dòng)血液生化分析儀(邁瑞，BC－3000)檢測(cè)血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)含量。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

血清堿性磷酸酶(AKP)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)以及腸道淀粉酶、胰蛋白酶、Na+，K+-ATP酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。AKP的活性單位定義為100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位;CAT的活性單位定義為每毫升血清每秒鐘分解1μmol H2O2的量為1個(gè)活性單位(U);T-SOD的活性單位定義為每毫升反應(yīng)液中T-SOD抑制率大于50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的T-SOD量為1個(gè)活性單位(U);淀粉酶的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個(gè)活性單位(U);胰蛋白酶的活性單位定義為在 pH 8.0、37℃條件下，每毫克組織蛋白質(zhì)含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003為1個(gè)活性單位(U);Na+，K+-ATP酶的活性單位定義為每小時(shí)每毫克組織蛋白質(zhì)中 Na+，K+-ATP酶分解 ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)活性單位(U)。組織中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.4 計(jì)算公式

特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×［ln末重(g)－ln初重(g)］/試驗(yàn)天數(shù)(d);

飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=總干物質(zhì)攝食量(g)/魚體總增重(g);

蛋白質(zhì)效率(protein efficiency rate，PER，%)=100×［末重(g)－初重(g)］/［總干物質(zhì)攝食量(g)×蛋白質(zhì)含量］;

攝食量(feed intake，F(xiàn)I，g/d)=總干物質(zhì)攝食量(g)×2/［(魚初始尾數(shù)+魚終末尾數(shù))×試驗(yàn)天數(shù)(d)］;

成活率(survival ratio，SR，%)=100 ×終末魚尾數(shù)(尾)/初始魚尾數(shù)(尾)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異達(dá)到顯著水平，則進(jìn)行Tukey多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，1 000 U/kg組羅非魚的末重、SGR和PER均顯著高于對(duì)照組和500 U/kg組(P＜0.05)，而對(duì)照組與500 U/kg組之間差異不顯著(P＞0.05)。各組羅非魚的 FCR、FI均差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)期間，各組羅非魚的SR均為100.00%。

表2 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of mannose on growth performance of tilapia

2.2 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚腸道消化酶活性的影響

由表3可知，隨著飼料中甘露聚糖酶添加水平的增加，羅非魚腸道中淀粉酶、胰蛋白酶、Na+，K+-ATP酶的活性均顯著升高(P＜0.05)。

2.3 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚血液代謝指標(biāo)的影響

由表4可知，1 000 U/kg組羅非魚血液AST活性、HDL-C含量顯著低于對(duì)照組和500 U/kg組(P ＜0.05)，而 TC、VLDL-C 含量卻顯著高于對(duì)照組和500 U/kg組(P＜0.05)。500 U/kg組羅非魚血液AST活性及 TC、VLDL-C和HDL-C含量與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。各組羅非魚血液TG、LDL-C含量及ALT活性均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表3 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚腸道消化酶活性的影響Table 3 Effects of mannase on intestinal digestive enzyme activities of tilapia U/mg prot

表4 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚血液代謝指標(biāo)的影響Table 4 Effects of mannase on blood metabolic indexes of tilapia

2.4 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚非特異性免疫力的影響

由表5可知，飼料中添加甘露聚糖酶對(duì)羅非魚全血白細(xì)胞總數(shù)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。500和1 000 U/kg組羅非魚全血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞百分比以及血清AKP活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而全血淋巴細(xì)胞百分比卻顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。500 U/kg組羅非魚全血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比以及血清AKP活性與1 000 U/kg組之間差異不顯著(P＞0.05)。500 U/kg組羅非魚血清CAT活性最高，其次是1 000 U/kg組，以對(duì)照組最低，各組間差異顯著(P＜0.05)。各組羅非魚血清T-SOD活性差異不顯著(P ＞0.05)。

表5 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚非特異性免疫力的影響Table 5 Effects of mannose on non-specific immunity of tilapia

3 討論

3.1 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加甘露聚糖酶能顯著促進(jìn)羅非魚的生長(zhǎng)。同樣，在飼料中添加甘露聚糖酶也能夠改善雞［5，12］和豬［6］的生長(zhǎng)效果。研究認(rèn)為，甘露聚糖酶能夠減輕或消除甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，降低動(dòng)物腸道食糜黏度，提高飼料能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。此外，甘露聚糖酶還能破壞植物飼料中細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)以供動(dòng)物機(jī)體利用，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露聚糖酶顯著提高仔豬血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子－1(IGF-1)的含量［14］。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，甘露聚糖酶對(duì)羅非魚生長(zhǎng)的促進(jìn)作用具有一定的劑量依賴性。關(guān)于甘露聚糖酶對(duì)羅非魚的促生長(zhǎng)作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.2 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚消化代謝的影響

研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加甘露聚糖酶可以提高肉雞［12］、斷奶仔豬［15］腸道中淀粉酶和胰蛋白酶的活性。本研究也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露聚糖酶不僅能夠提高羅非魚腸道淀粉酶和胰蛋白酶活性，還能夠提高腸道Na+，K+-ATP酶活性。這可能是魚類消化酶活性對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)組成變化的適應(yīng)性調(diào)整。而飼料中添加外源性甘露聚糖酶不影響羅非魚的攝食量，這進(jìn)一步說(shuō)明甘露聚糖酶可能是通過(guò)提高羅非魚腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)性能的改善。

大量研究證實(shí)，飼料中NSP含量升高會(huì)降低魚類飼料蛋白質(zhì)［16－17］或脂肪［17－18］的消化率，還會(huì)降低魚類血漿、肌肉中膽固醇含量［19－20］。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖酶高劑量(1 000 U/kg)組羅非魚血液中AST活性顯著降低，魚體蛋白質(zhì)沉積率增加，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶高劑量組羅非魚血液中TC含量顯著升高。這可能是因?yàn)楦事毒厶敲附档土孙暳现蠳SP的含量，提高了飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)和脂肪)的消化率。飼料中NSP的存在會(huì)使魚類腸道黏度增加，脂肪的乳化、分解受阻［21］。也有研究指出，NSP能包埋膽汁鹽，進(jìn)而使得動(dòng)物對(duì)脂肪的消化吸收減少［22］。由此可見(jiàn)，采用NSP酶制劑降低飼料中NSP含量可能是提高動(dòng)物對(duì)脂肪利用的一種有效途徑。

3.3 甘露聚糖酶對(duì)羅非魚非特異性免疫力的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加甘露聚糖酶可以顯著提高羅非魚血液中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比以及血清AKP和CAT活性，這在畜禽上也有相關(guān)的研究報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖酶能提高肉雞胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)［7］，增加愛(ài)拔益加雞血液中免疫球蛋白(Ig)M、IgG和IgA的含量［8］;在飼料中添加甘露聚糖酶會(huì)顯著提高斷乳仔豬血液中T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，血清IgA、IgG含量以及血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和AKP活性與總抗氧化能力(T-AOC)，而顯著降低血清丙二醛(MDA)含量［14］。這表明甘露聚糖酶能夠提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，但不同的動(dòng)物所表現(xiàn)的免疫指標(biāo)不同。在豬［14］、雞［23］和一些水產(chǎn)動(dòng)物［24－26］上的研究證實(shí)，甘露寡糖具有一定的免疫原性，能作為外源抗原佐劑與某些病原體表面結(jié)合刺激機(jī)體免疫應(yīng)答;也可結(jié)合或者阻塞病原體上的糖蛋白受體抑制其在宿主腸道內(nèi)增殖，調(diào)整腸道微生物區(qū)系;還能改善腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸道對(duì)病原微生物的防御作用。本試驗(yàn)中添加甘露聚糖酶能增強(qiáng)羅非魚的非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)，很可能是由于甘露聚糖酶降解甘露聚糖的產(chǎn)物甘露寡糖在發(fā)揮作用。有關(guān)甘露聚糖酶在魚類方面的免疫作用機(jī)理還有待深入研究。

4 結(jié)論

飼料中添加適宜水平的甘露聚糖酶可以提高羅非魚的消化吸收能力，增強(qiáng)非特異性免疫力，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

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