煙酸對錦江黃牛瘤胃乳酸、揮發(fā)性脂肪酸濃度及相關酶活性的影響

楊 艷 瞿明仁 歐陽克蕙 趙向輝 易中華 宋小珍

(1.江西農業(yè)大學動物科學技術學院，南昌 330045;2.江西省畜牧技術推廣站，南昌 330077)

近年來，由于動物生長性能和集約化程度的不斷提高，現代反芻動物生產中開始大量使用高比例精料的飼糧，以提高牛、羊生產水平和生產效率，但是，這往往導致動物采食量下降、瘤胃菌群失調、瘤胃酸中毒等。乳酸是瘤胃碳水化合物代謝過程中的一種中間產物，瘤胃內乳酸濃度的高低是瘤胃功能正常與否的一個重要指標。反芻動物瘤胃內乳酸濃度顯著升高是導致急性瘤胃酸中毒、瘤胃炎、肝水腫等代謝疾病的直接原因?；技毙粤鑫杆嶂卸镜牟⌒罂捎^察到瘤胃乳酸濃度由小于5 mmol/L 急劇上升到 50 ～120 mmol/L［1］，嚴重酸中毒時甚至超過300 mmol/L［2］。煙酸是動物必需營養(yǎng)素之一，是生物細胞氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成前體。一般情況下，反芻動物攝入與瘤胃合成的煙酸量足夠滿足其營養(yǎng)需要，一般不需要額外補充。但隨著“高精料短周期”肥育模式的推廣，反芻動物對煙酸等B族維生素的需求也越來越大［3－4］。NAD+是細胞生物化學過程中重要的輔因子，對生物體內多種生物代謝起重要的調控作用。那么在高精料飼糧條件下，精料比及煙酸對錦江黃牛瘤胃酸代謝是否有影響，影響的機制如何，目前尚不清楚，也鮮見報道。因此，本試驗對高精料飼糧條件下，添加煙酸對瘤胃乳酸及揮發(fā)性脂肪酸產生的影響進行研究，旨在探討瘤胃酸中毒新的調控思路和方法，減少酸中毒所造成的巨大經濟損失，促進反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、設計及飼糧

選用3頭平均體重為(275±20)kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的錦江黃牛，采用精料比例逐步提高來誘導酸中毒的試驗方法。試驗分4期，每期10 d，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期依次飼喂精料比例分別為60%、70%、80%的飼糧，研究不同精料比例對錦江黃牛瘤胃乳酸及揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響;第Ⅳ期研究在精料比例為80%的飼糧條件下，添加煙酸對瘤胃乳酸及揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響。試驗動物每日飼喂2次(07:00和19:00)，自由飲水。

煙酸購于鄭州興禾化工有限公司，食品級，純度大于98%。煙酸添加量為800 mg/kg(根據歐陽克蕙等［5］研究報道確定)。試驗飼糧參照我國肉牛飼養(yǎng)標準(NY/T 815—2004)［6］設計，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 樣品的采集及預處理

每期最后3 d(13:00)采集樣品。分別在瘤胃高、中、低3點采集瘤胃液各50 mL，每頭牛分別取樣分裝。取1 mL瘤胃液，12 000 r/min離心5 min，去掉上清液，添加 300 μL HCl(0.2 mol/L)，萃取NAD+，破壞掉 NADH，50℃水浴10 min，然后迅速放在冰中冷卻至0℃，接著逐滴添加300 μL NaOH(0.1 mol/L)進行中和，1 mL 槍頭反復吹打混勻，12 000 r/min離心10 min，將上清液移至另一管中待用，－80℃保存用于NAD+濃度的測定;另取1 mL瘤胃液，12 000 r/min離心5 min，去掉上清液，以300 μL NaOH(0.2 mol/L)萃取 NADH，添加300 μL HCl(0.1 mol/L)進行中和，其余步驟同NAD+，－80℃保存用于NADH濃度的測定［7］。

其余瘤胃液經4層消毒紗布過濾。取100 mL濾液迅速轉移至100 mL離心管中，1 500 r/min離心10 min，去除原蟲和飼料大顆粒后快速分裝，－80℃保存，以備測定揮發(fā)性脂肪酸、乳酸及丙酮酸濃度;另取10 mL濾液，6 mL立即測定總脫氫酶活性，剩余4 mL濾液4℃冷藏，12 h內測定乳酸脫氫酶活性。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 pH

瘤胃液采集后，充分混合，采用PHS－320型pH計立即測定pH。

1.3.2 揮發(fā)性脂肪酸濃度

采用氣相色譜法測定:杭州科曉GC－1690型氣相色譜儀，氫火焰離子化(FID)檢測器，OV－1701通用型毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)，2000色譜數據工作站，內標物為巴豆酸。采用程序升溫:初溫80℃，初時3.5 min，升速30℃/min，終溫180℃，終時10 min;進樣室溫度260℃，檢測器溫度260℃;柱前壓力0.05 MPa，氮氣作為載氣。樣品進樣量1μL。

1.3.3 丙酮酸、乳酸濃度及乳酸脫氫酶活性

采用TU－1810D型紫外可見分光光度計檢測，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 NAD+、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)濃度

參照李駱冰等［8］的方法。反應混合液:0.1 mol/L Bicine buffer(pH 8.0)2 mL、無水乙醇75 μL、12 mmol/L 噻 唑 藍 (MTT)100 μL、16.6 mmol/L乙硫吩嗪(PES)200 μL 混合，30 ℃水浴10 min。反應體系:依次添加50μL樣品、2 mL的反應混合液和20μL的乙醇脫氫酶(500 U/mL)，迅速混勻，測定。

標準曲線的制作:利用紫外可見分光光度計測定并得到標樣反應液在570 nm吸光度(A570nm)隨時間變化曲線，15 min內吸光度變化與時間成正比。試驗中取測定時間為7 min。繪制5個已知濃度標樣的A570nm隨時間變化曲線斜率圖，對每個標樣試驗點進行線性擬合，得到該標準濃度下A570nm隨時間變化曲線的斜率。以A570nm隨時間變化曲線斜率為橫坐標，以標準樣品濃度為縱坐標作圖，得到NAD+(或NADH)的標準曲線圖。

樣品測定:將樣品的A570nm隨時間變化曲線的斜率值代入標準曲線，得出相應的濃度值。

1.3.5 總脫氫酶活性

參照哈茲耶夫［9］的方法。對照管首先加入5 mL異丙醇，然后在對照管和樣品管各加入100目尼龍布過濾的新鮮瘤胃液2 mL及0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)混勻?；靹蚝罅⒓磳φ展芎蜆悠饭芊旁趨捬鯒l件下恒溫39℃水浴中準確反應10 min。樣品管迅速加入5 mL異丙醇終止反應。3 min后將對照管和樣品管的反應液以4 000 r/min離心10 min。上清液稀釋15倍，于紫外可見分光光度計在485 nm處比色測吸光度(A485nm)。將在38.5℃、pH 6.8條件下，每分鐘引起測定液吸光度上升0.1的酶量定義為1個酶活單位。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值±標準誤表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 煙酸對瘤胃酸代謝的影響

由表2可知，在試驗第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加煙酸的情況下，隨著精料比例的提高，瘤胃pH顯著下降(P＜0.05);瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨著精料比例的提高而提高，70%、80%精料比例與60%精料比例之間差異顯著(P＜0.05)，但70%和80%精料比例之間差異不顯著(P＞0.05);而瘤胃中的丙酮酸、乳酸濃度及乳酸/丙酮酸也隨著精料比例的提高而提高，60%與70%精料比例之間差異不顯著(P＞0.05)，80%精料比例與60%、70%精料比例之間差異顯著(P ＜0.05)。

在試驗第Ⅲ、Ⅳ期，精料比例為80%條件下，與未添加煙酸相比，添加煙酸顯著提高了瘤胃pH及丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度(P＜0.05)，顯著降低了丙酮酸、乳酸濃度及乳酸/丙酮酸(P＜0.05)，而乙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸差異不顯著(P＞0.05)。

表2 煙酸對瘤胃酸代謝的影響Table 2 Effects of nicotinic acid on acid metabolism of rumen

2.2 煙酸對瘤胃中NAD+(H)濃度及與酸代謝有關酶活性的影響

由表3可知，在試驗第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加煙酸的情況下，各精料比例對瘤胃中NAD+濃度無顯著差異(P＞0.05)，但有隨著精料比例的提高而降低的趨勢;總脫氫酶活性隨著精料比例的提高而顯著降低(P＜0.05)。各精料比例對瘤胃中NADH濃度、NADH/NAD+無顯著影響(P＞0.05)，但有隨著精料比例的提高而提高的趨勢。

在試驗第Ⅲ、Ⅳ期，精料比例為80%條件下，與未添加煙酸相比，添加煙酸對瘤胃中NAD+、NADH濃度、NADH/NAD+、總脫氫酶活性均無顯著影響(P＞0.05)，但有提高 NAD+濃度，降低NADH濃度及NADH/NAD+的趨勢。

第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期瘤胃中均未檢出乳酸脫氫酶活性，而在試驗第Ⅲ期，精料比例為80%(未添加煙酸)條件下，瘤胃中檢出了乳酸脫氫酶，其活性為132.9 U/mL。

3 討論

3.1 精料比例對瘤胃酸代謝的影響

在試驗第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加煙酸的情況下，隨著精料比例的提高，瘤胃pH顯著下降;瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨著精料比例的提高而提高，70%、80%精料比例與60%精料比例之間差異顯著，但70%和80%精料比例之間差異不顯著。而瘤胃中的乳酸濃度及乳酸/丙酮酸也隨著精料比例的提高而提高，60%與70%精料比例之間差異不顯著，80%精料比例與60%、70%精料比例之間差異顯著?？梢?，瘤胃pH的顯著下降，主要是由于乳酸大量產生而導致的。同時，隨著精料比例的提高，60%、70%和80%精料比例使瘤胃中NADH濃度、NADH/NAD+有提高的趨勢，NAD+濃度有降低的趨勢。這可能是因為隨著精料比例的提高，飼糧中豐富的淀粉和糖類被瘤胃內各種微生物所降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖，然后經酵解轉化為丙酮酸，同時大量的 NAD+還原成 NADH，NADH/NAD+升高，促使了瘤胃乳酸產量的增加和乳酸/丙酮酸升高，這也說明了乳酸是瘤胃pH顯著下降的主要原因。因此，高精料飼糧對瘤胃酸代謝具有顯著影響，主要是使乳酸大量產生。如果長時間使用高精料飼糧具有酸中毒的危險。

表3 煙酸對瘤胃中NAD+(H)濃度及與酸代謝有關酶活性的影響Table 3 Effects of nicotinic acid on NAD+(H)concentrations and acid metabolism-related enzyme activities in rumen

3.2 煙酸對瘤胃酸代謝的影響

煙酸是動物必需營養(yǎng)素之一。一般情況下，反芻動物攝入與瘤胃合成的煙酸量足夠滿足其營養(yǎng)需要，不需要額外補充。但隨著動物生產性能的提高和飼糧結構的改變，對煙酸等B族維生素的需求也越來越大。有研究認為，煙酸有利于緩解反芻動物的高精料應激［3－4］。本研究結果表明，80%精料比例條件下，與未添加煙酸相比，添加煙酸顯著提高瘤胃pH，抑制了因精料比例提高而pH進一步下降，使瘤胃pH保持在正常范圍內。乳酸的酸度比揮發(fā)性脂肪酸高數十倍［10］，乳酸濃度升高可導致瘤胃pH迅速降低，本試驗條件下，添加煙酸使乳酸濃度、乳酸/丙酮酸顯著降低。因此，添加煙酸具有緩解瘤胃酸應激的作用。Brent等［3］報道，補飼煙酸有益于受到應激刺激的公牛，尤其是那些采食高精料飼糧有不良應激反應的公牛。Byers等［4］總結了14個試驗，發(fā)現肉牛飼糧中添加50～250 mg/kg煙酸可促進育肥家畜盡快適應育肥期飼糧，顯著提高平均日增重與飼料利用率。Niehoff等［11］研究表明煙酸的使用效果和基礎飼糧中精料比例有關。當基礎飼糧中精料比例為80%時，添加煙酸才有效。當飼糧中粗飼料含量達到50%時，添加煙酸效果不佳。這可能與低精料比例飼糧條件下，乳酸產生量小有關。

3.3 煙酸對瘤胃NAD+(H)濃度及乳酸脫氫酶活性的影響

煙酸是動物體內NAD+的直接前體，與碳水化合物代謝和乳酸的產生密切相關。乳酸脫氫酶是催化生成乳酸的關鍵酶，瘤胃內乳酸脫氫酶的活性反映了瘤胃的乳酸產生能力。NAD+是NADH的競爭性抑制劑，對乳酸脫氫酶有抑制作用。本研究結果表明，當未添加煙酸的情況下，由于飼糧精料比例的提高，消耗NAD+，使瘤胃中NAD+濃度下降，NADH濃度提高，而添加煙酸后則相反，NAD+濃度提高，NADH濃度下降。值得注意的是試驗第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期均未檢出乳酸脫氫酶，原因可能是檢測方法不夠靈敏，但不代表這3個試驗期瘤胃中沒有乳酸脫氫酶，而在試驗第Ⅲ期，精料比例為80%(未添加煙酸)的條件下，瘤胃中檢出了乳酸脫氫酶，其活性為132.9 U/mL，同時，其乳酸濃度也是4個試驗期中最大的，為1.184 mmol/L。這可能是在精料比例80%沒有添加煙酸時，NAD+濃度下降，降低其對乳酸脫氫酶的抑制作用，使乳酸脫氫酶活性大幅度升高，達到了本方法檢測的靈敏度。本研究結果與Krause等［12］、Russell等［13］研究結果相似。

4 結論

添加煙酸提高了瘤胃 NAD+濃度，降低了NADH濃度及NADH/NAD+，抑制了乳酸脫氫酶活性和乳酸產生，從而緩解瘤胃酸應激或酸中毒。

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