3R4F參比卷煙主流煙氣總粒相物的Ames試驗(yàn)*

尚平平，李 翔，聶 聰，趙 樂(lè)，孫學(xué)輝，彭 斌

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院煙草化學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室鄭州450001

#通訊作者，男，1972年10月生，博士，研究員，研究方向:煙草化學(xué)和煙草煙氣毒理學(xué)，E-mail:congnie@yahoo.com.cn

卷煙煙氣是由5 000 多種化合物組成的復(fù)雜氣溶膠，其中有69 種已經(jīng)確定為致癌物［1］，如B［a］P［2］、二甲基亞硝胺［3］、多環(huán)芳烴［4］等。國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心的煙草煙氣體外毒性測(cè)試工作組推薦采用中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)(Ames 試驗(yàn))，對(duì)卷煙主流煙氣總粒相物(total particulate matter，TPM)進(jìn)行一般毒性及遺傳毒性的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。Ames 試驗(yàn)是對(duì)受試化合物誘變作用的研究，由Ames［5］1966年建立并不斷改進(jìn)完善，在加與不加S9活化系統(tǒng)情況下，檢測(cè)化合物對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的誘變能力［6］。雖然國(guó)際煙草合作研究中心煙草煙氣體外毒性測(cè)試工作組對(duì)卷煙煙氣體外毒性評(píng)價(jià)給出了試驗(yàn)項(xiàng)目選擇的建議，但各研究機(jī)構(gòu)在進(jìn)行具體試驗(yàn)時(shí)采用的方法卻并不一致。作者對(duì)參比卷煙3R4F 進(jìn)行Ames 試驗(yàn)，從測(cè)試菌株選擇、S9濃度、預(yù)培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間共4個(gè)方面進(jìn)行探討，旨在為應(yīng)用Ames 試驗(yàn)評(píng)價(jià)卷煙主流煙氣TPM 遺傳毒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 肯塔基3R4F 參比卷煙(肯塔基大學(xué))，成年雄性SD 大鼠(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(豫)2005-0001)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng))。二甲基亞砜(DMSO，分析純，Amresco公司)，注射用多氯聯(lián)苯(美國(guó)Accustandard 公司)，疊氮鈉(Amresco 公司)，蒽胺(A Johnson Matthey 公司)，硝基芴(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，上層培養(yǎng)基瓊脂和底層培養(yǎng)基瓊脂(鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司分裝)，組氨酸和生物素(日本Solarbio 公司)。RM20H 轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)(德國(guó)BORGWALDT 公司)，AL204-IC 電子分析天平(瑞士METTLER)，T25組織分散器(德國(guó)IKA 公司)，SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，DK-S26恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，3-18K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma 公司)，Incucell222 生化培養(yǎng)箱(德國(guó)MMM 公司)，微量可調(diào)移液器(德國(guó)Eppendorf 公司)，全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀(法國(guó)Interscience 公司)。

1.2 溶液配制

1.2.1 受試TPM 的配制 按GB/T5606.1 抽取卷煙作為試驗(yàn)樣品，依據(jù)YC/T29-1996 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件在RM20H 轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)上，抽吸20 支3R4F參比卷煙，收集劍橋?yàn)V片上的TPM，以DMSO 萃取至10 g/L，然后分別稀釋至250、500、750、1 000、1 250、2 500 和5 000 mg/L。染毒劑量分別為0、25、50、75、100、125、250 和500 μg/皿。

1.2.2 S9制備及S9混合液的配制 S9的制備:以玉米油為溶劑，配制200 g/L 的多氯聯(lián)苯，按500 mg/kg 的劑量無(wú)菌注射入大鼠腹腔。5 d 后處死大鼠，取肝臟，用冰冷0.15 mol/L 的KCl 清洗肝臟，而后加入0.15 mol/L 的KCl 溶液，勻漿后4℃低溫離心，分裝，于－80℃保存?zhèn)溆谩9經(jīng)無(wú)菌檢查、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定(含量低于40 g/L)并經(jīng)間接致癌物(蒽胺)鑒定其生物活性合格。S9混合液的制備:參考加拿大衛(wèi)生部［7］《卷煙主流煙氣細(xì)菌回突變?cè)囼?yàn)》配制。其中每mL 體積分?jǐn)?shù)10% S9混合液含:PBS 835 μL、1.65 mol/L KCl+0.4 mol/L MgCl2溶液20 μL、G-6-P 5 μL、NADP 40 μL 及S9100 μL;每mL 體積分?jǐn)?shù)5% S9混合液含S950 μL，余與體積分?jǐn)?shù)10% S9混合液同。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)平板摻入試驗(yàn) 參考加拿大衛(wèi)生部《卷煙主流煙氣細(xì)菌回突變?cè)囼?yàn)》［7］、OECD471《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》［6］及GB 15193.4-2003［8］，制備底層平板和頂層培養(yǎng)基，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)平板摻入試驗(yàn)。試驗(yàn)包括加S9(+S9)和不加S9(－S9)活化系統(tǒng)兩部分，并設(shè)置自發(fā)突變組(受試物劑量為0)、溶劑(0.1 mL/皿DMSO)對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。在－S9活化系統(tǒng)時(shí)，TA97、TA100 和TA102 的陽(yáng)性對(duì)照為10 mg/L疊氮鈉，TA98 的陽(yáng)性對(duì)照為40 mg/L 硝基芴;+S9活化系統(tǒng)時(shí)，4 菌株的陽(yáng)性對(duì)照為20 mg/L 蒽胺。4菌株過(guò)夜培養(yǎng)后，細(xì)菌數(shù)不少于(1～2)×109mL－1。在保持45℃恒溫的2.0 mL 頂層培養(yǎng)基中依次加入0.5 mmol/L組氨酸-生物素溶液0.2 mL、新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的測(cè)試菌液0.1 mL、不同劑量的TPM 0.1 mL及體積分?jǐn)?shù)10%S9混合液0.5 mL 后，低速旋轉(zhuǎn)3 s左右，傾倒于底層平板上，頂層培養(yǎng)基均勻分布于底層平板表面后，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)，空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及每個(gè)劑量組均設(shè)3 個(gè)平行皿，試驗(yàn)重復(fù)3 次，取均值。以回突變菌落數(shù)為Y，TPM 劑量為X，得出劑量-反應(yīng)關(guān)系的回歸方程。

1.4 不同濃度活化系統(tǒng)對(duì)回變菌落數(shù)的影響 以TA98 和TA100 為測(cè)試菌株，分別采用體積分?jǐn)?shù)5%和10%2 種濃度的S9混合液，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)平板摻入試驗(yàn)。劑量設(shè)置同1.3，計(jì)數(shù)各平板的回突變菌落數(shù)，并求得劑量-反應(yīng)關(guān)系的回歸方程。溶劑組的回突變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回突變數(shù)的2 倍，說(shuō)明所選溶劑無(wú)致突變作用，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾;劑量組回突變菌落數(shù)超過(guò)自發(fā)回突變數(shù)2 倍，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系的，可認(rèn)為受試TPM 有致突變作用［7］。

1.5 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)回突變菌落數(shù)的影響 以TA98 和TA100 為測(cè)試菌株，將0.1 mL 新鮮菌液、0.1 mL 受試TPM 溶液(溶劑對(duì)照加0.1 mL DMSO)和0.5 mL S9混合液移入預(yù)冷的帶蓋帽無(wú)菌培養(yǎng)管內(nèi)，混勻后，在37℃下預(yù)培養(yǎng)0、20、40 和60 min，加入頂層培養(yǎng)基，混勻傾倒于底層平板，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，計(jì)數(shù)各組平板的回突變菌落數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行處理，采用t 檢驗(yàn)比較不同處理方法下劑量-反應(yīng)關(guān)系回歸系數(shù)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TPM 對(duì)沙門(mén)氏菌的致突變能力 TA98 和TA100 在S9存在時(shí)的陽(yáng)性回突變情況見(jiàn)圖1。不同劑量TPM 對(duì)沙門(mén)氏4 菌株誘發(fā)的回突變菌落數(shù)見(jiàn)表1。TPM 在1 000 mg/L 時(shí)，在+S9的情況下，回突變菌落數(shù)為自發(fā)突變數(shù)的2 倍以上，而且在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)顯示有劑量-反應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明卷煙主流煙氣TPM對(duì)TA98 顯示有致突變作用;無(wú)論S9活化系統(tǒng)存在與否，TPM 對(duì)其他3 種菌株均無(wú)致突變作用，表明TA98對(duì)卷煙主流煙氣TPM 較為敏感。4 菌株的診斷性誘變劑(陽(yáng)性對(duì)照)均顯示陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明S9及試驗(yàn)操作可靠。對(duì)TA100 和TA102 在+S9情況下的劑量-反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，回歸方程分別為^Y =147.60 +0.18X 和^Y =269.81 +0.12X，回歸系數(shù)經(jīng)t 檢驗(yàn)分析后，t =2.180，P =0.047，表明TA100 與TA102 的劑量-反應(yīng)關(guān)系差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)TA100 的回歸系數(shù)大于TA102 的回歸系數(shù)，表明在劑量范圍內(nèi)TA100 比TA102 的回突變能力強(qiáng)。

2.2 不同濃度S9混合液的活化能力比較 37℃培養(yǎng)48 h 后，TPM 各劑量組的測(cè)試菌株菌苔背景良好。由表2可知，不同濃度S9作用，TPM 均對(duì)TA98顯示有致突變作用。經(jīng)t 檢驗(yàn)分析后，體積分?jǐn)?shù)分別為5%和10% S9活化系統(tǒng)下，TA98 和TA100 的劑量-反應(yīng)關(guān)系回歸系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明TA98 和TA100 在5%和10% S9活化系統(tǒng)下的劑量-反應(yīng)關(guān)系無(wú)差異。

2.3 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)回變菌落數(shù)的影響 對(duì)TPM 進(jìn)行不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的Ames 試驗(yàn)后，結(jié)果見(jiàn)表3、4。20、40 和60 min 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下劑量-反應(yīng)關(guān)系的回歸系數(shù)與未預(yù)培養(yǎng)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)培養(yǎng)20 min 的TPM 在劑量為75 μg/皿時(shí)，已顯示有對(duì)TA98 的致突變作用，而且對(duì)于TA98 和TA100，僅有預(yù)培養(yǎng)20 min 時(shí)的劑量-反應(yīng)關(guān)系回歸系數(shù)的數(shù)值大于未預(yù)培養(yǎng)。

表1 不同劑量TPM 對(duì)沙門(mén)氏4 種菌株誘發(fā)的回突變菌落數(shù)(n=3)個(gè)/皿

表2 不同濃度S9 作用后TPM 對(duì)TA98 和TA100 致突變情況(n=3)個(gè)/皿

表3 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下TPM 對(duì)TA98 的致突變情況(n=3)個(gè)/皿

表4 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下TPM 對(duì)TA100 的致突變情況(n=3)個(gè)/皿

3 討論

卷煙主流煙氣中含有B［a］P、4-氨基聯(lián)苯、多環(huán)芳烴等多種改變機(jī)體遺傳物質(zhì)的有害成分，而這些有害成分之間可能存在相互作用，因此研究單一有害成分的毒性作用是不具有代表性的。該研究采用3R4F 參比卷煙主流煙氣的TPM 作為受試物，通過(guò)Ames 試驗(yàn)來(lái)判斷卷煙煙氣的致基因突變能力。Ames 試驗(yàn)從核酸水平研究化學(xué)物的毒性作用，具有快速、有效、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，其敏感度和特異度為80%～90%［9］，是目前國(guó)際上普遍采用的檢測(cè)環(huán)境中大量潛在致癌物通用的初篩方法之一［10］。

TA97 和TA98 可檢出移碼突變，TA100 和TA102 可檢出堿基置換和移碼突變［7］。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，在S9存在下，TA98 和TA100 兩種菌株對(duì)TPM相對(duì)比較敏感，與1995年Steele 等［11］的報(bào)道一致，并且TA98 和TA100 的組合同樣能檢測(cè)出移碼突變和堿基置換，因此，在研究卷煙煙氣TPM 的致突變能力時(shí)，可采用這兩種菌株進(jìn)行。由于不同誘變劑所需S9的濃度不同，在進(jìn)行Ames 試驗(yàn)時(shí)，每平板S9的含量直接關(guān)系到誘變劑的最佳誘變作用，作者采用體積分?jǐn)?shù)5%和10%兩種S9濃度進(jìn)行活化作用比較。結(jié)果表明兩者的活化效果基本一致，因此S9濃度選擇以5%為佳，可以在保證試驗(yàn)結(jié)果有效的前提下，使Ames 試驗(yàn)更為簡(jiǎn)便、省時(shí)和節(jié)約。

卷煙煙氣是含有大量化合物的復(fù)雜氣溶膠，其中的化合物的毒性作用千差萬(wàn)別，該試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法的基礎(chǔ)上增加了預(yù)培養(yǎng)階段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)37℃預(yù)培養(yǎng)20 min 后，回突變菌落數(shù)普遍增加，這是由于較高溫度下孵育TPM、細(xì)菌和S9，可能提高了TPM 中某些遺傳毒性物質(zhì)敏感性。同時(shí)，隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，回突變菌落數(shù)增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，可能由于長(zhǎng)時(shí)間的孵育，引起S9的活性降低，或是長(zhǎng)時(shí)間接觸較高濃度的TPM 出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，從而影響了TPM 對(duì)細(xì)菌的致突變作用。

該試驗(yàn)通過(guò)比較Ames 試驗(yàn)的不同影響因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以TA98 和TA100 為測(cè)試菌株，體積分?jǐn)?shù)為5%的S9活化系統(tǒng)，預(yù)培養(yǎng)20 min 可以有效檢測(cè)3R4F 參比卷煙主流煙氣TPM 的誘變作用。

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