兩種滸苔無(wú)機(jī)碳利用對(duì)溫度響應(yīng)的機(jī)制

徐軍田，王學(xué)文，鐘志海，姚東瑞，2

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，連云港 222005;2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，南京 210014)

溫度是影響生物過(guò)程最普遍的氣候因素。迄今為止向大氣排放的CO2已經(jīng)使得地球比工業(yè)革命前變暖2.4℃，全球暖化的趨勢(shì)在本世紀(jì)還將進(jìn)一步的加速 (IPCC 2001)，預(yù)計(jì)本世紀(jì)末溫度將上升2—5℃，這將帶來(lái)許多生物種的滅絕［1］。大型海藻構(gòu)成海洋總初級(jí)生產(chǎn)力的10%左右，是近岸海域重要的初級(jí)生產(chǎn)者，在近岸碳循環(huán)中起著很重要的作用［2］。溫度的變化對(duì)大型海藻的生長(zhǎng)、代謝、碳平衡等產(chǎn)生重要影響，并進(jìn)而影響到海藻季節(jié)與地理分布狀況［3］。

在自然海水中，在通常的pH值(8.0—8.2)和20℃條件下的濃度約為2mmol，而 CO2僅為10 μmol，由于Rubisco利用CO2的半飽和常數(shù)(Ks)為30—60 μmol［4］。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，許多大型海藻形成了無(wú)機(jī)碳濃縮機(jī)制(CCMs)來(lái)更有效地利用無(wú)機(jī)碳進(jìn)行光合作用。除直接利用擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的CO2外，CCMs主要包括以下途徑:①依賴胞外碳酸酐酶(CA)的催化脫水形成 CO2，CO2進(jìn)而被細(xì)胞吸收利用［5］;②在細(xì)胞膜外酸性區(qū)域脫水而形成CO2，CO2進(jìn)而被細(xì)胞吸收利用［6］;③ 耗能的的直接吸收利用(此過(guò)程可被抑制劑DIDS所抑制)［7］;④的協(xié)同運(yùn)輸或的反向運(yùn)輸［6］。這些機(jī)制得到了廣泛的研究，實(shí)驗(yàn)主要以改變培養(yǎng)介質(zhì)里的無(wú)機(jī)碳濃度以及pH值來(lái)測(cè)定這種機(jī)制的變化，但對(duì)于溫度的效應(yīng)，卻未見(jiàn)報(bào)道。

滸苔(Ulva prolifera)和緣管滸苔(Ulva linza)是沿海潮間帶常見(jiàn)的大型綠藻，也是近幾年來(lái)綠潮爆發(fā)的主要種類，其生理特性對(duì)環(huán)境的變化得到了很好的研究［8-12］，在此基礎(chǔ)上本文以這兩種滸苔為材料，研究無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制對(duì)溫度的響應(yīng)，為探討近岸大型海藻無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制與溫度變化的關(guān)系提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)了解綠潮在響應(yīng)全球變暖過(guò)程中的變化提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

緣管滸苔(Ulva linza)和滸苔(Ulva prolifera)分別采自于江蘇連云港高公島和連島海域。材料用過(guò)濾海水清洗干凈后，選取色澤鮮綠，長(zhǎng)度適中的健康藻體于玻璃水族箱內(nèi)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)的條件是溫度為15℃，光強(qiáng)為200μmol m-2s-1，光周期為12h∶12h;培養(yǎng)液為過(guò)濾的自然海水，每2d更換1次，每天24h通氣培養(yǎng)。

1.2 pH值漂移曲線的測(cè)定

稱取0.3g的緣管滸苔和滸苔藻體放于含有15ml過(guò)濾滅菌海水(pH值為8.0)的小玻璃瓶中，玻璃瓶放置于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，將藻體充分舒展后封閉，水體用磁力攪拌器均勻攪動(dòng)，光照控制為200μmol m-2s-1，溫度為15℃。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小瓶口接一個(gè)pH計(jì)探頭，每隔一定的時(shí)間記錄pH的變化，當(dāng)pH穩(wěn)定后結(jié)束測(cè)定，這個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)就是pH值補(bǔ)償點(diǎn)。

1.3 光合作用的測(cè)定

用氧電極法(Hansatech，英國(guó))測(cè)定緣管滸苔和滸苔的光合放氧速率。測(cè)定之前，把藻體用鋒利的小剪刀剪成約0.2 cm2大小的小片(緣管滸苔)和約1cm長(zhǎng)的小條(滸苔)，在室內(nèi)低光下適應(yīng)1—2h(溫度設(shè)定為測(cè)定時(shí)的溫度)，最大程度的消除藻體損傷帶來(lái)的測(cè)定誤差。然后稱取大約20 mg鮮重的藻片(大約20片)放入裝有2 mL反應(yīng)介質(zhì)的反應(yīng)槽中。用循環(huán)水浴精確控制反應(yīng)槽內(nèi)的溫度。飽和光強(qiáng)設(shè)置為600μmol m-2s-1。

1.4 無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制的研究

為精確研究溫度對(duì)緣管滸苔和滸苔無(wú)機(jī)碳利用的影響，采用藻類碳酸酐酶的抑制劑AZ(acetazolamide)和EZ(6-ethoxyzolamide)(Sigma)(用0.05 mol/L NaOH配制成5mmol/L的原液)，最終反應(yīng)介質(zhì)中的濃度為100μmol。AZ不能滲透細(xì)胞而只抑制胞外CA酶的活性［13-14］，而EZ能滲透細(xì)胞從而抑制胞內(nèi)和胞外CA兩者的活性［15］。通過(guò)和不加抑制劑的藻樣進(jìn)行對(duì)比，從光合作用的光響應(yīng)曲線來(lái)分析溫度的效應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA(turkey)分析(采用Origin 7.0分析軟件)，設(shè)顯著水平為P＜0.05，所有實(shí)驗(yàn)處理均為3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

pH漂移曲線表明這兩種滸苔都有很強(qiáng)的無(wú)機(jī)碳利用能力，其pH補(bǔ)償點(diǎn)分別高達(dá)10.19±0.01(緣管滸苔)和10.08±0.01(滸苔)(圖1)。

圖1 緣管滸苔和滸苔在15℃、光強(qiáng)為200μmol m－2s－1的pH漂移曲線Fig.1 The pH-drift curves of Ulva linza and Ulva prolifera under 20℃ and 200μmol m－2s－1condition

為了探討溫度對(duì)兩種滸苔無(wú)機(jī)碳利用能力的影響，測(cè)定了藻體在不同溫度下和加入不同抑制劑情況下的最大放氧速率，從圖中可以看出，緣管滸苔的最大光合作用速率(Pmax)隨著溫度的升高而顯著增加，到25℃達(dá)到最大，但在30℃顯著下降，下降比率為56%。當(dāng)加入抑制劑AZ后，除在15℃外，其他溫度下的Pmax受到顯著的抑制。其Pmax隨著溫度的變化模式為，隨著溫度的升高，Pmax也顯著增加，但到15℃后，Pmax維持在一個(gè)恒定的水平，直到30℃才顯著下降。而加入抑制劑EZ后，藻體的Pmax在所有的溫度下與加入AZ相比受到了更顯著的抑制，其Pmax隨溫度的變化模式為，隨著溫度的升高，Pmax也顯著增加，在30℃具有最大的Pmax(圖2)。通過(guò)抑制劑對(duì)光合作用的抑制率來(lái)看，AZ處理的藻體在5℃和30℃最大，達(dá)到70%，而在15℃最小，抑制率為零。整個(gè)抑制率隨著溫度的變化呈“V”字形變動(dòng)。而EZ處理的藻體，抑制率隨溫度的變化基本維持在85%的水平，只是在30℃時(shí)光合作用的抑制水平下降為80%(圖2)。

滸苔的最大光合作用速率(Pmax)隨著溫度的升高而顯著增加，到25℃達(dá)到最大，但在30℃顯著下降，其下降比率與緣管滸苔相比要小，僅為20%。當(dāng)加入抑制劑AZ后，所有溫度下藻體的Pmax都受到顯著的抑制，其隨著溫度的變化趨勢(shì)和對(duì)照情況下一致，都是隨著溫度的升高而顯著增加，在25℃達(dá)到最大，但在30℃顯著下降。加入抑制劑EZ后，藻體的Pmax在所有的溫度下與加入AZ相比受到了更顯著的抑制，其Pmax隨溫度的變化模式為，5℃下滸苔具有最低的Pmax，10℃處理下滸苔的Pmax約是5℃的2.5倍，但隨著溫度的增加，Pmax卻一直保持在10℃時(shí)的水平上，其處理間沒(méi)有顯著差異(圖3)。通過(guò)抑制劑對(duì)光合作用的抑制率來(lái)看，AZ處理的藻體在5℃時(shí)最低，僅為16%，在10℃時(shí)其抑制率上升為55%，隨著溫度的上升，抑制率卻保持穩(wěn)定的水平，除5℃外，其他所有溫度間的抑制水平?jīng)]有顯著差異。而EZ處理的藻體，抑制率隨溫度的變化在5℃和10℃較低，約為70%，隨著溫度的增加，其他溫度處理下的抑制率基本維持在85%的水平(圖3)。

圖2 緣管滸苔在正常和抑制劑AZ和EZ存在情況下最大光合作用速率隨溫度的變化圖以及這兩種抑制劑對(duì)藻體最大光合作用速率的抑制率Fig.2 The change of the maximum photosynthetic rate of Ulva linza as function of temperatures with or without AZ and EZ inhibitors and the inhibition ratio of AZ and EZ for the maximum photosynthetic rate

圖3 滸苔在正常和抑制劑AZ和EZ存在情況下最大光合作用速率隨溫度的變化圖以及這兩種抑制劑對(duì)藻體最大光合作用速率的抑制率Fig.3 The change of the maximum photosynthetic rate of Ulva prolifera as function of temperatures with or without AZ and EZ inhibitors and the inhibition ratio of AZ and EZ for the maximum photosynthetic rate

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，緣管滸苔和滸苔的pH漂移曲線說(shuō)明這兩種海藻具有很強(qiáng)的無(wú)機(jī)碳利用能力，一般認(rèn)為一種海藻的pH補(bǔ)償點(diǎn)達(dá)到9.2以上就表示其具有有效的利用能力［16-17］，而這兩種海藻的pH補(bǔ)償點(diǎn)可以高達(dá)10以上，這表明這兩種海藻存在一種或者幾種高效的體外無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)形式。研究表明，緣管滸苔和滸苔具有明顯的胞外和胞內(nèi)碳酸酐酶活性，這是大型海藻胞外CA酶催化的利用方式，是大型海藻無(wú)機(jī)碳利用的最普遍和最基本的方式［18-19］。而胞外CA酶活性本身僅僅是加速與CO2之間的相互轉(zhuǎn)化，而不能影響CO2的平衡濃度，并且形成的CO2主要是通過(guò)擴(kuò)散作用而被動(dòng)的進(jìn)入細(xì)胞。這就意味著，這種方式的利用，在高pH(＞9.4)時(shí)就不能很好地起作用，因?yàn)檫@時(shí)的CO2平衡濃度極低［20-21］。因此這表明，除胞外碳酸酐酶催化利用的方式外，緣管滸苔和滸苔必定還存在另外的利用方式。這在同屬的腸滸苔(Ulva intestinalis)中得到證實(shí)，其有兩種利用能力，即通過(guò)胞外CA酶催化的利用，以及通過(guò)陰離子交換蛋白抑制劑(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonic acid，DIDS)敏感機(jī)制的直接吸收［21］。

通過(guò)比較緣管滸苔在不同溫度下AZ對(duì)其最大光合作用速率抑制率，得到在溫度最低的5℃和最高的30℃下，其抑制水平達(dá)到70%左右，這表明在這兩個(gè)溫度下無(wú)機(jī)碳的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過(guò)胞外碳酸酐酶的催化作用，而其他的轉(zhuǎn)運(yùn)方式僅占很少的比例。而在15℃，加入胞外碳酸酐酶的抑制劑對(duì)藻體光合作用速率沒(méi)有顯著影響，這表明在這個(gè)溫度下其他的轉(zhuǎn)運(yùn)方式可以彌補(bǔ)碳酸酐酶轉(zhuǎn)運(yùn)方式所起到的作用。而其他的溫度下碳酸酐酶和其他轉(zhuǎn)運(yùn)方式各占有一定的比例。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除碳酸酐酶外的轉(zhuǎn)運(yùn)方式對(duì)溫度具有很強(qiáng)的依賴性，在溫度很低或者很高的情況下，其效率與碳酸酐酶相比受到明顯的抑制，其最適的溫度為15℃，在這個(gè)溫度下其高的效率完全可以替代碳酸酐酶來(lái)為藻體進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)運(yùn)。

而對(duì)于滸苔來(lái)說(shuō)，無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制對(duì)溫度的響應(yīng)和緣管滸苔有顯著的差異，AZ在溫度最低的5℃具有最低的Pmax抑制率，其抑制水平僅為16%，這表明在低溫的情況下，除胞外碳酸酐酶的活性外，其他的轉(zhuǎn)運(yùn)方式占有很高的比例。而從10℃開(kāi)始，這種抑制水平就達(dá)到一個(gè)很高的值，并且一直保持在這個(gè)水平上(55%)，這表明，當(dāng)溫度升高到10℃以后，碳酸酐酶催化轉(zhuǎn)運(yùn)所占的比率顯著增加，其他的轉(zhuǎn)運(yùn)方式在無(wú)機(jī)碳利用過(guò)程中的作用與5℃相比顯著下降，并且在10℃以后直到30℃，這種比率保持恒定。

緣管滸苔光合作用能力最強(qiáng)的溫度是在25℃，而加入抑制劑EZ后，最高光合作用的溫度為30℃，但這表明光合作用體系(包括光合作用電子傳遞、固碳以及碳獲取的各個(gè)組分)里酶的最適溫度是不相同的，EZ抑制了胞內(nèi)外碳酸酐酶的活性，導(dǎo)致胞內(nèi)無(wú)機(jī)碳庫(kù)產(chǎn)生向Rubisco供應(yīng)的CO2過(guò)程受到抑制［15］，藻體利用的CO2是胞內(nèi)碳酸鹽系統(tǒng)中自然解離的產(chǎn)物，這樣藻體的光合作用能力取決于RUBISCO酶的活性以及CO2的解離速度。而正常情況下，光合作用能力的大小必須要考慮無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)體系里各種酶的活性以及效率。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在30℃情況下，無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)體系受到了一定程度的抑制，導(dǎo)致光合作用能力顯著下降。

但對(duì)滸苔來(lái)說(shuō)，其光合作用能力最強(qiáng)的溫度也為25℃，加入抑制劑EZ后，最高光合作用速率從15℃開(kāi)始就保持恒定的水平，這表明，在不同溫度下影響光合作用能力的主要是無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)體系所起的作用，當(dāng)這些轉(zhuǎn)運(yùn)體系受到抑制后，藻體僅僅是利用海水中和體內(nèi)自然化學(xué)解離形成的CO2，溫度對(duì)其光合作用過(guò)程中各種酶的活性沒(méi)有顯著的影響。

綜上所述，溫度對(duì)緣管滸苔和滸苔的無(wú)機(jī)碳利用轉(zhuǎn)運(yùn)體系的影響是不同的，他們之間存在著明顯的種間差異，緣管滸苔對(duì)溫度的依賴性要強(qiáng)于滸苔，其對(duì)溫度的適應(yīng)范圍要窄于滸苔，尤其是在高溫下(30℃)，緣管滸苔的最大光合作用能力與最適溫度相比下降了56%，而滸苔僅為20%，這表明在高溫的情況下，滸苔比緣管滸苔具有更強(qiáng)的生存適應(yīng)能力，這是滸苔能夠在綠潮藻占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的原因之一，并且在北方海域滸苔綠潮的調(diào)查研究中得到證實(shí)［9］。對(duì)于緣管滸苔和滸苔的無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制來(lái)說(shuō)，其他轉(zhuǎn)運(yùn)的方式是在正常海水pH下就可以起到有效的作用，還是當(dāng)胞外碳酸酐酶受到抑制后的誘導(dǎo)使其產(chǎn)生作用，這還需要進(jìn)一步的研究。

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