十字花科植物FAE1基因的克隆與功能驗證

龐 慧，李 瑩，李密密，嚴琴琴，杭悅宇，孫小芹

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物遷地保護重點實驗室，江蘇南京210014〕

FAE1基因是第1個被發(fā)現(xiàn)的調控芥酸等超長鏈脂肪酸合成的關鍵基因［1］，該基因主要通過編碼β－酮酯酰 CoA 合酶(KCS)控制芥酸合成［1－2］，同時也在蠟質及鞘脂類等超長鏈脂肪酸的合成中起重要作用［3］。FAE1基因最初克隆自擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Hey.〕［4］，其后主要克隆自十字花科(Brassicaceae)植物，如從甘藍型油菜(Brassica napus Linn.)、白菜型油菜(B.campestris Linn.)、芥菜型油菜(B.juncea Linn.)、黑芥(B.nigra Linn.)、白芥(Sinapis alba Linn.)和中歐芥〔Teesdalia nudicaulis(Linn.)R.Br.〕等種類中均獲得 FAE1 基因［5－10］。雖然不同種類的FAE1基因在長度與序列上存在差異，但均無內含子。目前，F(xiàn)AE1基因的克隆方法主要有轉座子標簽法、探針法及EcoTILLING法(ecotype targeting induced local lesions in genomes)等［4，7，11］，其中最常見的方法為同源序列擴增法［8，10］。

FAE1基因的功能驗證主要包括酵母與植物轉基因驗證，這些研究大多也在十字花科植物中進行。酵母中脂肪酸延長酶活性很低，只能合成微量的超長鏈脂肪酸，是研究 FAE1編碼蛋白活性的常用體系［12－13］。Millar等［14］將擬南芥的 FAE1 基因轉化到酵母中，發(fā)現(xiàn)隨著FAE1基因的表達長鏈脂肪酸在酵母中累積;而將諸葛菜〔Orychophragmus violaceus(Linn.)O.E.Schulz〕和薺〔Capsella bursa-pastoris(Linn.)Medikus〕2種零芥酸種類的 FAE1基因轉化到酵母中，雖然都能表達出預期的蛋白產(chǎn)物，但卻無長鏈脂肪酸的累積［9，15］;中歐芥及海甘藍(Crambe abyssinica Hochst.ex R.E.Fr.)的栽培品種‘Prophet’的FAE1基因功能除了在酵母中得到驗證，還被轉化至擬南芥中，同樣發(fā)現(xiàn)該基因能顯著促進長鏈脂肪酸的累積［16－17］。此外，將擬南芥的FAE1基因轉化到煙草(Nicotiana tabacum Linn.)中，隨 FAE1基因的表達長鏈脂肪酸在煙草中累積;在擬南芥中過量表達FAE1基因，其長鏈脂肪酸含量也明顯提高［14］。由此可見，雖然十字花科種類很多，但FAE1基因的克隆與功能驗證研究主要集中于蕓薹屬(Brassica Linn.)植物及擬南芥，而在其他十字花科植物中FAE1基因的特性尚未見研究報道。

鑒于此，作者對十字花科8屬9種1亞種的FAE1基因進行了克隆、比對及功能驗證，以期對十字花科植物中FAE1基因存在的普遍性及功能的相似性進行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的十字花科8屬9種1亞種包括蕓薹屬的非洲芥菜(B.tournefortii Gouan，原產(chǎn)地印度)、埃塞俄比亞芥(B.carinata A.Braun，原產(chǎn)地加拿大)和短喙芥(B.elongata Ehrhart，原產(chǎn)地伊朗);芝麻菜屬(Eruca Miller)的芝麻菜〔E.vesicaria subsp.sativa(Miller)Thellung，原產(chǎn)地波蘭〕;蘿卜屬(Raphanus Linn.)的野蘿卜(R.raphanistrum Linn.，原產(chǎn)地印度);兩節(jié)薺屬(Crambe Linn.)的 C.filiformis Jacq.(原產(chǎn)地加拿大);菥蓂屬(Thlaspi Linn.)的菥蓂(T.arvense Linn.原產(chǎn)地波蘭);臭薺屬(Coronopus Zinn)的臭薺〔C.didymus(Linn.)Smith，原產(chǎn)地中國江蘇〕;薺屬(Capsella Medikus)的薺〔C.bursa-pastoris(Linn.)Medikus，原產(chǎn)地中國江蘇〕;碎米薺屬(Cardamine Linn.)的小花碎米薺(C.parviflora Linn.，原產(chǎn)地中國江蘇)。其中，非洲芥菜、埃塞俄比亞芥和C.filiformis種子由加拿大植物種質資源庫(Plant Gene Resources of Canada，PGRC)提供，短喙芥、芝麻菜、野蘿卜和菥蓂種子由美國種質資源庫(Germplasm Resources Information Network，GRIN)提供;臭薺、薺和小花碎米薺種子均采自南京中山植物園。種子萌發(fā)后栽培于本所種質圃，幼苗長出后采集新鮮幼嫩葉片備用。

1.2 方法

1.2.1 FAE1基因的克隆與序列分析 按改良的CTAB法［18］從葉片中提取基因組DNA。在引物TF/TR［16］兩側分別加上 KpnI與 BamHI酶切位點，合成TFK引物(序列為5'－CGGGGTACCGCAATGACGTCC GTTAAC－3')和 TRB 引物(序列為 5'－CGCGGATCC GGACCGACCGTTTTGGAC－3')。使用TFK和TRB引物對各種類的FAE1基因進行擴增。

用PE－9700型PCR儀(Perkin Elmer公司生產(chǎn))進行PCR 反應。擴增體系總體積20 μL，包含2.0 μL 10×PCR buffer、0.2 mmol·L－1dNTPs、2.0 mmol·L－1Mg2+、0.2 μmol·L－1引物、0.4 U Taq DNA 聚合酶和20 ng模板DNA，以滅菌雙蒸水補足至20 μL。PCR反應程序為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，53℃退火40 s，72℃ 延伸1 min，共35個循環(huán);最后于72℃保溫7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用質量體積分數(shù) 0.8%的瓊脂糖凝膠(含 0.5 μg·mL－11×EB)電泳約1 h，用WV－BP330凝膠掃描分析系統(tǒng)(江蘇捷達科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))進行觀察和拍照。按AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒方法將擴增產(chǎn)物進行割膠純化，按pMD19－T載體試劑盒方法將純化產(chǎn)物連接到pMD19－T載體〔購自寶生物工程(大連)有限公司〕上，通過PCR篩選的陽性克隆交上海華大基因有限公司進行測序。

用Sequencher軟件對測序峰圖進行編輯和拼接，采用Clustal W軟件進行序列比對分析，用MEGA5.1軟件對DNA和蛋白質序列的同源性進行比較。

1.2.2 FAE1基因的酵母轉化和表達分析 酵母轉化及培養(yǎng)參照文獻［12］進行。用BamHI/KpnI雙酶切pMD19－T重組載體，將目的片段連接到酵母表達載體pYES2/NT C(Invitrogen出品)上，位于載體半乳糖誘導表達啟動子的下游，通過表達產(chǎn)生N末端融合了(His)6Gly標簽的融合蛋白;以空載體pYES2/NT C作為陰性對照，轉化到酵母菌株InvSc1中，并在含質量體積分數(shù)2%葡萄糖但不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上(SC－ura)進行暗培養(yǎng)并篩選。轉化的酵母細胞接種到含質量體積分數(shù)2%葡萄糖的SC－ura液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下振蕩暗培養(yǎng)過夜;用含質量體積分數(shù)2%半乳糖的SC－ura液體培養(yǎng)基將其稀釋到OD600=0.02，并繼續(xù)振蕩暗培養(yǎng)至 OD600=1.4;將酵母培養(yǎng)物分為等量的2份，分別用于Western blot分析及氣相色譜分析。

1.2.3 Western blot分析 用酵母蛋白提取試劑盒(南京凱基公司，Cat No.KGP650)提取酵母細胞總蛋白，然后用HisBind resin純化蛋白。參照文獻［12］進行Western blot分析，采用10%SDS－PAGE凝膠電泳，蛋白質分子量標準為PageRuler Prestained Protein Ladder(Fermentas公司出品)。將分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上進行Western blot分析，然后用一抗HisG抗體和堿性磷酸酶標記的二抗羊抗兔IgG檢測，最后顯色。

1.2.4 氣相色譜分析 酵母細胞的脂肪酸分析參照文獻［12］進行。酵母細胞用超純水洗滌2次;然后用質量體積分數(shù)10%KOH－體積分數(shù)95%甲醇的混合溶液于80℃皂化反應2 h，反應結束后置于冰上冷凍，再用正己烷洗滌以去除未皂化物;剩余水相用6 mol·L－1HCl酸化。用正己烷萃取游離脂肪酸，減壓濃縮以去除多余溶劑;游離脂肪酸用含1%H2SO4的甲醇溶液2 mL于60℃條件下甲基化1 h;然后用正己烷萃取脂肪酸甲酯，減壓去除溶劑，剩余物用于氣相色譜分析，脂肪酸含量采用峰面積歸一法計算。

2 結果和分析

2.1 FAE1基因的克隆和序列分析

用引物TFK/TRB對供試的9種1變種的FAE1基因進行擴增，均得到Rf值相等的單一條帶，其中，芝麻菜、Crambe filiformis、野蘿卜、菥蓂、非洲芥菜、埃塞俄比亞芥和短喙芥的FAE1序列長度均為1 521 bp，臭薺的FAE1序列長度為1 517 bp，薺和小花碎米薺的FAE1序列長度為1 518 bp。所有種類的FAE1基因序列已在GenBank上登錄，非洲芥菜、埃塞俄比亞芥、短喙芥、芝麻菜、野蘿卜、Crambe filiformis、菥蓂、臭薺、薺和小花碎米薺的登錄號分別為JX898749、JX898750、JX898751、JX898752、JX898753、JX898754、JX898755、JX898756、JX898757 和 JX898758。

供試的9種1亞種的FAE1序列相似性較高，相似度達89%。比對分析結果表明:對位排列矩陣長度為1 521 bp，其中，保守位點1 051個，占序列總長度的69.1%;變異位點470個，占總長度的30.9%;簡約信息位點232個，占總長度的15.3%。臭薺、薺和小花碎米薺的FAE1序列在第132位均缺失3個堿基，臭薺的FAE1序列在第515位缺失1個堿基。

基于擬南芥的FAE1序列(GenBank登錄號NM_119617.2)，將供試種類的FAE1基因序列翻譯成氨基酸序列，獲得的氨基酸序列長度存在差異，但絕大部分編碼完整。芝麻菜、Crambe filiformis、野蘿卜、菥蓂、非洲芥菜、埃塞俄比亞芥和短喙芥的FAE1基因編碼506個氨基酸，薺與小花碎米薺的編碼505個氨基酸;而臭薺由于在515 bp處缺失1個堿基，導致其FAE1基因編碼的氨基酸序列提前終止，僅編碼186個氨基酸。比對分析結果顯示:供試9種1亞種的FAE1基因編碼的氨基酸序列也高度相似，相似度達88.9%;各種類的氨基酸序列間存在151個變異位點，其中有6個位點與種子芥酸相對含量有關(表1)。

2.2 FAE1基因功能的驗證

2.2.1 Western blot分析結果 將供試9種1亞種的FAE1基因所構建的表達載體轉化至酵母中，經(jīng)Western blot分析，發(fā)現(xiàn)它們的FAE1基因在酵母中均表達出預期的蛋白產(chǎn)物，且編碼蛋白的分子量相似，相對分子質量均為60 000左右。其中臭薺的FAE1基因由于移碼突變只編碼包含186個氨基酸的蛋白質，但實際上轉化至酵母中仍可表達出分子量正常的蛋白產(chǎn)物;而從含有pYES2/NT C空載體的酵母菌株(對照)中則未檢測出目標蛋白(圖1)。

表1 十字花科植物FAE1基因編碼的氨基酸序列變異位點與其種子芥酸相對含量的對應分析Table 1 Corresponding analysis of variable site of amino acid sequence encoded by FAE1 gene from Brassicaceae species to relative content of erucic acid in seed

圖1 十字花科植物FAE1基因的轉化酵母細胞中表達產(chǎn)物的Western blot分析結果Fig.1 Analysis result of Western blot of expression product in transformed yeast cell of FAE1 gene from Brassicaceae species

2.2.2 氣相色譜分析結果 用氣相色譜法分析各種類FAE1基因轉化酵母中的芥酸含量，結果見表2。由表2可見:在作為對照的含pYES2/NT C空載體的酵母細胞中沒有檢測出芥酸，而在非洲芥菜、埃塞俄比亞芥、短喙芥、菥蓂、芝麻菜、野蘿卜、C.filiformis和薺FAE1基因的轉化酵母細胞中均有芥酸積累，其中在薺FAE1基因的轉化酵母細胞中芥酸相對含量最高，達4.63%;而在臭薺和小花碎米薺FAE1基因的轉化酵母細胞中芥酸相對含量均為0.00%。

表2 十字花科植物FAE1基因轉化酵母細胞中芥酸相對含量的比較Table 2 Comparison of relative content of erucic acid in transformed yeast cell of FAE1 gene from Brassicaceae species

3 討論和結論

3.1 FAE1基因編碼的氨基酸序列與轉化酵母細胞中芥酸含量的關系

前人對擬南芥及油菜突變體的研究結果［19］顯示:在FAE1基因編碼的氨基酸序列中有11個位點的任何一個發(fā)生突變，會導致高芥酸種類(通常種子中芥酸含量大于30%的為高芥酸種類，芥酸含量小于10%的為低芥酸種類［12］)的FAE1基因轉化酵母細胞中芥酸含量為0，這11個位點是6個半胱氨酸位點(Cys84、Cys223、Cys270、Cys312、Cys389 和 Cys460)、4個組氨酸位點(His302、His387、His391和 His420)及絲氨酸/苯丙氨酸位點(Ser/Phe282)。但武玉花等［9］的研究結果顯示:這11個位點未發(fā)生任何變異，推測其他氨基酸位點的變異也與FAE1基因轉化酵母的芥酸含量相關。本研究結果與武玉花等的結果基本一致，在本研究涉及的高、低芥酸種類中這11個位點也并未有任何變異，說明這11個位點的進化十分保守。而前人有關脂肪酸延長酶活性位點的研究是在遺傳背景一致的材料間(如同種的不同品種間)進行的，因而在不同的物種間這些變異并不穩(wěn)定。在本研究中，由FAE1編碼的氨基酸序列的151個變異位點中有6個氨基酸變異位點與轉化酵母的芥酸含量相關，如第14位氨基酸殘基在轉化酵母有芥酸積累的埃塞俄比亞芥等7種植物中為異亮氨酸，而在轉化酵母無芥酸積累的臭薺和小花碎米薺中為亮氨酸，同樣的情形還可見于第22位的苯丙氨酸/亮氨酸、第56位的異亮氨酸/纈氨酸、第106位的纈氨酸/異亮氨酸、第122位的色氨酸/絲氨酸、第286位的精氨酸/甘氨酸，因此，這6個氨基酸位點的變異可能是導致轉化酵母無芥酸積累的原因之一，當然，這一結論還有待于采用定點突變實驗加以驗證。

從序列上看，由于移碼突變，臭薺的FAE1基因只編碼186個氨基酸，但在轉化酵母中仍可表達出分子量正常的蛋白產(chǎn)物，這也許是由于基因本身的終止密碼子比突變出現(xiàn)的終止密碼子更有競爭優(yōu)勢，因而使基因仍可通讀;但其轉化酵母中的芥酸相對含量為0.00%，表明該編碼蛋白并無酶活性，在酵母細胞中不能催化長鏈脂肪酸的合成。

3.2 FAE1基因轉化酵母的芥酸含量與其種子芥酸含量的關系

前人的研究結果表明:十字花科植物的種子芥酸含量高，其FAE1基因轉化至酵母中也使酵母細胞中的芥酸含量相應提高，反之亦然;如高芥酸植物油菜(Brassica napus Linn.)、甘藍(B.oleracea Linn.)和蕪青(B.rapa Linn.)的一些栽培品種，其FAE1基因轉化酵母中芥酸含量可達1.94% ～2.19%;而低芥酸栽培植物B.napus‘Westar’的FAE1基因轉化酵母中芥酸含量為0%［12－13］;同樣的情形也存在于高芥酸甘藍型油菜‘中油821’、新疆白芥、新疆野芥(Sinapis arvensis Linn.)、菘藍(Isatis indigotica Fort.)及低芥酸植物諸葛菜和薺中［9］。

本課題組前期對十字花科94種野生植物種子芥酸含量的分析結果表明［15］:非洲芥菜等6種1亞種的種子芥酸含量均高于30%，為高芥酸種類;臭薺與小花碎米薺種子芥酸含量為0.00% ～1.30%，為低芥酸種類。本研究結果顯示:在非洲芥菜等6種1亞種FAE1基因的轉化酵母細胞中芥酸相對含量為0.27%～2.50%，而在臭薺和小花碎米薺FAE1基因的轉化酵母中芥酸相對含量為0.00%，證實了前期的研究結果;同時，除薺外的8種1亞種的種子芥酸相對含量與轉化酵母細胞中的芥酸含量呈正相關(r=0.493)，更明確了植物種子芥酸含量與該物種FAE1基因轉化酵母細胞中芥酸含量的正相關關系。

3.3 薺的FAE1基因克隆與功能驗證

前期的測定結果顯示薺的種子中芥酸相對含量為0.61%，為低芥酸種類［15］，其 FAE1基因轉化酵母細胞中芥酸相對含量卻遠高于其他高芥酸種類，表明其編碼的脂肪酸延長酶具有很高活性，這種特例之前未見報道。推測其原因可能是在薺體內受到各式元件調控而導致FAE1基因功能不正常，但在酵母表達系統(tǒng)中其基因編碼區(qū)脫離了各式調控元件的作用，從而恢復正常功能;也可能是由于FAE1基因在植物體內可能受到包括甲基化在內的基因修飾和調節(jié)作用，關閉了該基因的活性，而在酵母中去甲基化后基因又重新活化表達［20］。在本實驗過程中薺的FAE1基因擴增十分困難［9］，作者也是嘗試多次后才獲得成功，這一現(xiàn)象也可能是該基因發(fā)生甲基化作用的佐證。

致謝:美國種質資源庫與加拿大植物種質資源庫饋贈部分種類的種子，中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所盧長明研究員與武玉花助理研究員饋贈酵母菌株與質粒，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所高建芹副研究員完成脂肪酸的氣相色譜分析，在此一并致謝!

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