以α－葡萄糖苷酶活性抑制率為指標優(yōu)化山茱萸果肉的提取條件

李慧敏，劉艷妮，王小蕊，康杰芳

(陜西師范大學教育部藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室生命科學學院，陜西西安710062)

山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉是三大名貴木本藥材之一［1］。新鮮山茱萸果肉中含有單糖、多糖、有機酸、苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮、蒽醌、甾體和內(nèi)酯等成分［2］，臨床上多用山萸肉和酒山萸肉;山茱萸是常用的降血糖藥物［3］，常出現(xiàn)在中醫(yī)降血糖的組方中?，F(xiàn)代藥理研究結果表明:山茱萸所含的糖蛋白、熊果酸、齊墩果酸、多糖、苷類、鞣質(zhì)和環(huán)烯醚萜類等成分都具有降血糖效果［4－11］。α－葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸黏膜刷狀緣α－葡萄糖苷酶對食物中淀粉和糖類的降解，延遲并減少葡萄糖的吸收，從而降低餐后血糖;目前常用的此類降糖藥物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，但價格高、副反應和毒副作用較大，因此從天然動植物和礦物中尋找低毒、高效的α－葡萄糖苷酶抑制劑具有廣闊的應用前景。

作者采用α－葡萄糖苷酶抑制劑微孔板高通量篩選模型，用單因素和正交實驗設計相結合的方法對山茱萸果肉中α－葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝進行優(yōu)化，為山茱萸果肉中降血糖活性成分的提取及深入開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試山茱萸果肉于2011 年10 月至11 月采集于陜西佛坪，經(jīng)陜西師范大學植物學教研室鑒定為山茱萸的干燥成熟果肉，標本存放于陜西師范大學生命科學學院。稱取去核的果肉400 g，粉碎并過40 目篩后備用。

供試的二甲基亞砜(DMSO)、α－葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)和4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷(PNPG)均為美國Sigma公司出品，其余試劑均為分析純。Anthos Zenyth 3100 酶標儀產(chǎn)自北京惠安澤泰科技有限公司，RE－52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀產(chǎn)自上海亞榮生化儀器廠，XH－B 型旋渦混合器產(chǎn)自姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司，KQ－600DB 臺式數(shù)控超聲波清洗器產(chǎn)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山茱萸果肉提取液的基礎制備流程 準確稱取果肉粗粉 0.5 g，根據(jù)不同實驗設計的要求按料液比(W ∶V)1∶10 加入體積分數(shù)40%乙醇，振蕩搖勻，放置3 h 后在30 ℃、420 W 條件下超聲處理20 min，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，加入乙醚萃取油脂后靜置10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醚味，即為果肉提取液，可直接用于α－葡萄糖苷酶活性抑制率的測定。

1.2.2 α－葡萄糖苷酶活性測定 參照文獻［12］的方法略加優(yōu)化。在96 微孔板上每孔加0.1 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)180 μL，及 α－葡萄糖苷酶 15 μL 和提取液 4 μL，混勻后于37 ℃恒溫處理 15 min;加入10 mmol·L－1PNPG 30 μL，混勻后于37 ℃恒溫反應15 min;于波長405 nm 處測 OD值(ODc)。每個樣品重復測定3 次，取平均值，計算抑制率。另設對照組a(用緩沖液代替樣品提取液)、空白對照組b(用緩沖液代替α－葡萄糖苷酶和樣品提取液)和樣品對照組d(用緩沖液代替α－葡萄糖苷酶和底物)，其余測定流程均相同，分別獲得ODa、ODb和ODd，按以下公式計算抑制率:抑制率(I)=〔1－(ODc－ODd)/(ODa－ODb)〕×100%。此外，設置阿卡波糖陽性對照組e，測定阿卡波糖對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.3 單因素實驗設計 根據(jù)上述基礎流程，分別設置料液比、乙醇濃度、超聲處理溫度和處理時間4 個單因素實驗。其中料液比(W ∶V)分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和 1∶30;乙醇體積分數(shù)分別為10%、20%、40%、60%、80%和100%;超聲處理溫度分別為 20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃ 、60 ℃ 和 70 ℃;超聲處理時間為 10、20、30、40、50 和 60 min。每一單因素實驗中除涉及的因素外，其余提取流程均與上述基本流程相同，并按上述方法測定提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.4 正交實驗設計 在單因素實驗基礎上，采用L9(34)正交實驗設計。料液比(W ∶V)為1∶10、1∶15 和1∶25;乙醇體積分數(shù)為30%、40%和50%;超聲處理時間為30、40 和50 min;超聲處理溫度為50 ℃、60 ℃和70 ℃。按上述基礎流程制備提取液并測定對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率;并對獲取的最優(yōu)條件進行驗證實驗，3 次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

用Origin 軟件計算果肉提取液對α－葡萄糖苷酶的半抑制濃度(IC50)，并與陽性對照阿卡波糖的IC50進行對比。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果和分析

2.1 單因素實驗結果

在料液比、乙醇濃度、超聲處理溫度和時間不同的條件下獲得的果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率見圖1。

由圖1－A 可知:隨提取過程中料液比的增大，山茱萸果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制作用增強。其中，料液比1 ∶5 至1∶15，獲得的提取液的抑制率明顯升高;此后，抑制率趨于平穩(wěn)。從成本角度考慮，料液比1∶15 比較適宜。

由圖1－B 可知:提取過程中加入體積分數(shù)10% ～40%乙醇，獲得的果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率隨乙醇體積分數(shù)的提高逐漸增加;用體積分數(shù)40%乙醇提取，獲得的提取液抑制率最大。因此，最適宜的乙醇體積分數(shù)約為40%。

圖1 在不同提取條件下獲得的山茱萸果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig. 1 Inhibition rate of extract from Cornus officinalis Sieb. et Zucc. flesh obtained under different extraction conditions to α-glucosidase activity

由圖1－C 可知:隨提取過程中超聲處理時間的延長，獲得的果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率逐漸增大;處理時間超過40 min，獲得的提取液的抑制率趨于平緩。因此，最佳超聲處理時間約為40 min。

由圖1－D 可知:隨提取過程中超聲處理溫度的升高，獲得的果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制作用逐漸增強;處理溫度高于60 ℃，獲得的提取液的抑制率趨于平緩。所以，最適宜的超聲處理溫度約為60 ℃。

2.2 正交實驗結果及最佳提取條件的驗證

正交實驗結果表明(表1):不同提取因素與山茱萸果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性抑制率有不同程度的關系，其中超聲處理溫度對α－葡萄糖苷酶活性抑制率的影響程度最大，而超聲處理時間的影響程度最小。根據(jù)K 值推測山茱萸果肉的最優(yōu)提取條件為 D3C2A3B1，即料液比 1∶15(W ∶V)、乙醇體積分數(shù)50%、超聲處理溫度70 ℃、超聲處理時間30 min。

表1 山茱萸果肉提取液不同提取條件的正交實驗結果Table 1 Result of orthogonal experiment of different extraction conditions of extract from Cornus officinalis Sieb. et Zucc. flesh

根據(jù)前述最優(yōu)提取條件重復提取3 次，獲得的果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為98.39%、98.43%和98.40%，平均值為 98.41%，RSD 為 0.021%，說明該提取條件穩(wěn)定，且重現(xiàn)性良好。

將山茱萸果肉提取液配制成不同濃度并測其對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率，其 IC50為409.30 mg·L－1，遠低于陽性對照品阿卡波糖的IC50(890.48 mg·L－1)，說明采用最佳提取條件獲得的果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性抑制作用明顯。

3 結 論

正交實驗結果表明:在料液比1∶15、加入體積分數(shù)50%乙醇、超聲處理溫度70 ℃和超聲處理時間30 min 的條件下獲得的山茱萸果肉提取液對α－葡萄糖苷酶活性的抑制率最高，達98.5%。該提取條件穩(wěn)定且重現(xiàn)性好。

山茱萸營養(yǎng)與藥用價值均較高;山茱萸醇提物對糖尿病大鼠有明顯的降糖作用，但對正常大鼠血糖無明顯影響，且山茱萸總萜可以提高正常小鼠糖耐量，降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的血糖值，提高血清胰島素水平［11］。因而，對山茱萸降糖作用的深入研究將有廣泛的應用前景。

［1］王花紅，郭五保，顧 瑩，等. 山茱萸藥材指紋圖譜的研究［J］.西北植物學報，2004，24(10):1922－1928.

［2］于 淼，王曉先，賈 琳. 山茱萸的藥理作用研究進展［J］. 東南國防醫(yī)藥，2010，12(3):240－243，260.

［3］高大威，范玉生，李 娜，等. 山茱萸活性成分的鑒定及降糖效果的研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008(12):92－94.

［4］唐成康，高小平，徐大勇，等. 山茱萸糖蛋白的純化及部分理化性質(zhì)研究［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(12):147－151.

［5］HSU J H，WU Y C，LIU I M，et al. Release of acetylcholine to raise insulin secretion in Wistar rats by oleanolic acid，one of the active principles contained in Cornus officinalis［J］. Neuroscience Letters，2006，404:112－116.

［6］許惠琴，朱 荃. 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對實驗性糖尿病腎病的保護作用［J］. 南京中醫(yī)藥大學學報，2003，19(6):342－344.

［7］馬慶一，陳麗華，楊海延，等. 山茱萸中α－葡萄糖苷酶抑制活性因子的篩選(Ⅰ)［J］. 食品科學，2007，28(1):167－170.

［8］YOKOZAWA T，YAMABE N，KIMH Y，et al. Protective effects of morroniside isolated from Corni Fructus against renal damage in streptozotocin-induced diabetic rats［J］. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2008，31:1422－1428.

［9］YAMABE N，NOH J S，PARK C H，et al. Evaluation of loganin，iridoid glycoside from Corni Fructus， on hepatic and renal glucolipotoxicity and inflammation in type 2 diabetic db/db mice［J］. European Journal of Pharmacology，2010，648:179－187.

［10］YAMABE N，KANG K S，GOTO E，et al. Beneficial effect of Corni Fructus， a constituent of Hachimi-ji-gan， on advanced glycation end-product-mediated renal injury in Streptozotocintreated diabetic rats［J］. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2007，30:520－526.

［11］韓璟超，季 暉，薛城鋒，等. 山茱萸總萜的降血糖作用［J］.中國天然藥物，2006，4(2):125－129.

［12］張 麗. 滇丁香、茜草抑制α－葡萄糖苷酶活性成分研究［D］.開封:河南大學藥學院，2007:4－5.