TLC-生物自顯影法篩選榆葉合葉子的抗氧化活性

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011

榆葉合葉子(Filipendula ulmaria L.)為薔薇科蚊子草屬多年生草本植物，榆葉合葉子是新疆哈薩克族民間常用藥材，收載于《哈薩克藥志》。榆葉合葉子味微酸澀，性平。具有收斂，降壓等作用，哈薩克族民間應(yīng)于主治高血壓、高血脂引起的頭痛、頭暈、耳鳴[1]，具有悠久的哈薩克醫(yī)臨床用藥歷史和確切的療效。此外榆葉合葉子還具有抗炎、止血、抗?jié)?、抗凝血、抗腫瘤、傷口治療、保肝、抗糖尿病和健腦等作用[2-3]。

TLC-生物自顯影法是一種將薄層色譜分離和生物活性測(cè)定相結(jié)合的藥物篩選方法，現(xiàn)主要用于對(duì)具有抗菌/真菌,抑制膽堿酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性成分的篩選[4]。榆葉合葉子中主要含有苯酚類、黃酮類和鞣質(zhì)類等成分[5-6]，本文首先建立了榆葉合葉子中黃酮類物質(zhì)的TLC鑒別方法，并采用TLC-生物自顯影法對(duì)榆葉合葉子的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行抗氧化活性成分的初步篩選。

1 儀器與材料

半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(CAMAG LINOMAT5)，薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG REPROSTAR3)，100μl微量進(jìn)樣針，超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1mg)，雙槽展開(kāi)缸(20cm×20cm)。

金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)：MUST-11122003)；繡線菊苷對(duì)照品(批號(hào)：00019345-104)；蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20120226)，槲皮素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-2009907)，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基乙醇(2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl，DPPH)(SIGMA)，榆葉合葉子由新疆醫(yī)科大學(xué)帕力達(dá)教授采集并鑒定。其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取一定粉碎度的榆葉合葉子花和全草藥材粉末0.5g，用2*50ml甲醇索氏提取法提取，減壓蒸發(fā)干燥，稱重后，殘?jiān)?ml甲醇溶解配制成供試品溶液備用。

圖1 不同展開(kāi)系統(tǒng)的榆葉合葉子藥材非揮發(fā)性 成分薄層色譜圖 A. 乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)； B.醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)； C.丙酮-水-甲酸(20∶0.5∶0.5)； 從左至右分別為：花的樣品，全草樣品，混標(biāo)； 混標(biāo)從上至下分別為：槲皮素，繡線菊苷，金絲桃苷，蘆丁

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分取吸取繡線菊苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素對(duì)照品適量，以甲醇制成每1ml含0.5mg的混標(biāo)溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 展開(kāi)系統(tǒng)的選擇 分別吸取榆葉合葉子花和全草供試品溶液2μl和對(duì)照品溶液 2μl，點(diǎn)于同一薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)、醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)、丙酮-水-甲酸(20∶0.5∶0.5)3種不同展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，取出，晾干，噴以顯色劑，105℃加熱5min至斑點(diǎn)清晰，紫外光366nm下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)圖中斑點(diǎn)數(shù)目、分離度和拖尾情況確定乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)為最佳展開(kāi)系統(tǒng)。

圖2 不同檢視條件下的榆葉合葉子藥材非揮發(fā)性成分薄層色譜圖 A.可見(jiàn)光下檢視；B.紫外光254nm下檢視； C.紫外光366nm下檢視； 從左至右分別為：花的樣品，全草樣品，混標(biāo)； 混標(biāo)從上至下分別為：槲皮素，繡線菊苷，金絲桃苷，蘆丁

圖3 榆葉合葉子黃酮類物質(zhì)抗氧化活性篩選 從左至右分別為：花的樣品，全草樣品，混標(biāo)； 混標(biāo)從上至下分別為：槲皮素，繡線菊苷，金絲桃苷，蘆丁

2.4 不同檢視方式的考察 分別吸取榆葉合葉子花供試品溶液2μl、榆葉合葉子全草供試品溶液2μl和對(duì)照品溶液2μl，點(diǎn)于同一薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以顯色劑，105℃加熱5min至斑點(diǎn)清晰，分別在可見(jiàn)、紫外光254nm和紫外光366nm下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明,榆葉合葉子藥材薄層色譜圖中金絲桃苷、繡線菊苷、蘆丁和槲皮素在3種檢視條件下均斑點(diǎn)清晰，但在紫外光366nm下檢視效果更佳，表明此鑒別方法重復(fù)性好。

2.5 TLC-生物自顯影法 分別吸取榆葉合葉子花供試品溶液、全草供試品溶液和對(duì)照品溶液 2μl，點(diǎn)于同一薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以 0. 1% 1,1-二苯基-2-苦肼基自由基乙醇(2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl，DPPH)無(wú)水乙醇溶液顯色，105℃加熱5min至斑點(diǎn)清晰，105℃加熱5min至斑點(diǎn)清晰，可見(jiàn)光下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖3。薄層板呈紫色背景黃色斑點(diǎn)，說(shuō)明榆葉合葉子中黃酮類物質(zhì)有抗氧化活性。

3 討論

本研究首先建立了榆葉合葉子黃酮類物質(zhì)的TLC方法，并將TLC-薄層生物自顯影法引入到對(duì)榆葉合葉子的抗氧化活性研究中，初步篩選出榆葉合葉子的黃酮類成分具有抗氧化活性，從篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)榆葉合葉子中的繡線菊苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素都具有抗氧化活性，由展開(kāi)斑點(diǎn)可初步推斷，四種成分的抗氧化能力為槲皮素>蘆丁>金絲桃苷>繡線菊苷，但進(jìn)一步的確定還需要進(jìn)行定量分析，另外由篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)榆葉合葉子樣品的TLC-生物自顯影法薄層板上樣品的斑點(diǎn)成條帶狀，說(shuō)明榆葉合葉子中含有豐富的抗氧化活性成分，且其花的抗氧化活性強(qiáng)于全草的，但是由于榆葉合葉子中的黃酮類成分較多，采用普通有機(jī)展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行分離可以進(jìn)行較好的薄層鑒別，但是用于TLC-生物自顯影法時(shí)，不能較好的分離顯示斑點(diǎn)，如何更好的運(yùn)用TLC-生物自顯影法將樣品中的各黃酮類成分分離的更加清晰是接下來(lái)研究的重點(diǎn)。

[1] 王仁.哈薩克藥志[M].新疆：新疆科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

[2] E.A.Krasnov，V.A.Raldugin，I.V.Shilova，et al.Phenolic compounds from filliendula ulmaria[J].Chemistry of Natural Compounds, 2006.42(2):148-151.

[3] LA Liapina，GA Koval’chuk. A comparative study of the action on the hemostatic system of extracts from the flowers and seeds of the meadowsweet (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.) [J].Seriia Biologicheskaia/Rossiiskaia Akademiia Nauk，1993，4(7)：625-628.

[4] 曲建博，婁紅祥，范培紅.LC生物自顯影技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用[J].中草藥，2005，36(1)：132-137.

[5] HD Smolarz，A Sokolowska-Wozniak.Chromatographic analysis of phenolic acids in Filipendula ulmaria (L.) Maxim and Filipendula hexapetala Gilib [J].Chemical & Environmental Research.，2003，12(2)：77-82.

[6] Shilova IV，Semenov AA，Suslov NI，et al. Chemical composition and biological activity of a fraction of meadowsweet extract[J].Pharmaceutical Chemistry Journal，2009，43(4)：185-190.