三神散對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響及其機制研究

延邊大學中醫(yī)學院，吉林 延吉 133002

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是由于腦血管疾病導致的認知功能障礙臨床綜合征。VD是引起老年性癡呆的第二病因，其研究近年來備受關注。本研究主要采用雙側頸總動脈結扎法制成血管性癡呆大鼠模型，探索三神散對 VD大鼠在學習記憶功能的作用及其作用機制，為 VD的防治提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 三神散(遠志、石菖蒲、龍骨)購自延吉市中醫(yī)醫(yī)院；喜得鎮(zhèn)片(批準文號：國藥準字H1010054，產品批號：050177)；乙酰膽堿酯酶試劑盒購自Sigma公司。

1.2 實驗儀器 Morris水迷宮及其記錄分析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設備有限公司研制)；臺式低溫離心機(日本SYNYO 公司)；冰凍切片機(德國)；HM-200型電子天平(日本)。

1.3 實驗動物 SPF級大鼠，體重200～250g，雌雄各半，由延邊大學實驗動物中心提供。

1.4 動物模型制備及分組給藥 采用大鼠雙側頸總動脈結扎法制作VD模型。具體方法如下：10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠背位固定，保證大鼠呼吸暢通。頸前部去毛，碘伏消毒后行頸正中切口l～2cm，鈍性分離雙側頸總動脈后，用l號線將其永久性結扎。局部消毒后縫合頸部肌肉和皮膚，將大鼠置于保溫臺上，直至清醒。模型組和給藥組行上述手術處理，假手術組僅分離而不結扎頸總動脈。造模后7周手術組動物隨機分為模型組、喜得鎮(zhèn)組、三神散低劑量組(10mg/kg)、三神散中劑量組(20mg/kg)和三神散高劑量組(30mg/kg)，共6組，每組7只。術后8周分別灌胃給予三個劑量的三神散，3次/周，連續(xù)給藥4周；喜得鎮(zhèn)組按0.6mg/kg灌服，假手術組、模型組灌胃等量生理鹽水。

1.5 Morris水迷宮測試 灌胃結束前5天，開始進行Morris水迷宮測試。Morris水迷宮主要裝置包括一個直徑160cm，高60cm的黑色圓柱形水池及一套圖像自動采集處理系統(tǒng)。池壁有4個入水點可將水池均分為4個象限。在目標象限中央放置一個直徑10cm，高23cm的隱藏平臺。水溫維持在(22±1)℃，水面高于隱藏平臺0.8cm，室溫保持在(24±1)℃。實驗期間水迷宮周圍參照物不變。試驗前一天，大鼠在水迷宮中自由游泳5min熟悉環(huán)境。定位航行實驗：實驗歷時4d，每天分上午、下午兩個時段分別測試，每只各測試2次。訓練時將大鼠面向池壁從不同象限輕放入水中，同時記錄其在120s內四肢爬上平臺的時間，即上臺潛伏期(APLP)。

1.6 超氧化物歧化(SOD)、丙二醛(MDA)、Ach含量測定 水迷宮測試結束后，動物麻醉后開胸，用真空采血管(預先涂有促凝劑)心臟取血，采血針從左心室進入取血后離心(3000rpm，10min)，取上清液。利用黃嘌呤氧化法與硫代巴比妥酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。斷頭處死大鼠，于冰臺上取出腦組織，剔除小腦及腦干。冰生理鹽水沖凈表面血跡，濾紙拭干，電子天平稱重。在冰盒內使用玻璃勻漿器制備10%的腦組織勻漿，4℃離心(4 000 r/min×10 min)，取上清進行實驗，采用堿性羥胺法測定乙酰膽堿(Ach)含量。

2 結果

2.1 三神散對VD大鼠行為學的影響 定位航行試驗中，模型組的逃避潛伏期較假手術組明顯延長(P<0.05)；與模型組相比，干預組、三神散高劑量組大鼠APLP明顯縮短，差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.2 三神散對VD大鼠SOD、Ach含量及MDA活性的影響 與假手術組比較，模型組SOD、Ach含量明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.05)；與模型組比較，喜得鎮(zhèn)組、三神散高、中、低劑量組SOD、Ach含量明顯升高(P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。

表1 三神散對各組大鼠上臺潛伏期的影響

表2 三神散對VD模型大鼠SOD活性、 MDA及Ach含量的影響

3 討論

血管性癡呆病因較為復雜，但以缺血性腦血管疾病為最多見，現(xiàn)已證明[1-2]，腦缺血可引起腦組織損傷和功能障礙，影響最明顯的部位是腦前區(qū)和海馬紋狀體區(qū)，其損傷機制與氧自由基損傷、細胞內鈣離子超載、興奮性氨基酸的神經毒作用、血管活性物質的過度釋放、腦內乙酰膽堿[3]含量降低等有關。大量研究表明，這些細胞內外信號的改變可從不同途徑影響學習記憶相關的通路而引起功能障礙。Morris水迷宮實驗常用于檢驗空間學習能力和參考記憶。本實驗觀察到，經三神散治療后，大鼠 Morris水迷宮逃避潛伏期同模型組相比縮短，差異有顯著性意義(P<0.01)，提示VD大鼠空間學習記憶得到改善。三神散主要由龍骨、石菖蒲、遠志組成，現(xiàn)代藥理學研究表明，龍骨[6]鎂離子可參與神經沖動的傳遞和神經肌肉應激性的維持等生理功能活動，它可使運動神經末稍乙酰膽堿釋放減少，具有中樞抑制和骨骼肌松弛作用。遠志[5]水煎可通過提高體內抗氧化能力，清除衰老或老化機體過多生成的自由基，抑制或減輕機體組織和細胞的過氧化過程，起到延緩衰老的作用。石菖蒲[4]能增加中樞神經系統(tǒng)的耐缺氧能力，抑制腦細胞凋亡，保護因缺血、缺氧引起的神經功能減退。實驗結果證明三神散能提高Ach和SOD含量，降低MDA含量，改善學習記憶功能。

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