產類細菌素乳酸菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

陳宏偉 地力扎爾·阿扎提 張秀萍*

(1 新疆生產建設兵團畜牧科技重點實驗室，阿拉爾新疆 843300)

(2 塔里木大學動物科學學院，阿拉爾新疆 843300)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群形態(tài)代謝性能和生理學特征不完全相同的能發(fā)酵碳水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱［1］。乳酸菌產品以其獨特的生物學功能呈現(xiàn)出前所未有的商業(yè)開發(fā)利用價值。乳酸菌產生具有抑菌或殺菌效果的有機酸、過氧化氧、雙乙酰和細菌素。乳酸菌細菌素以其安全、高效、無毒副作用和無抗藥性等優(yōu)點，已經(jīng)引起廣大從事食品防腐劑、飼料添加劑以及醫(yī)藥開發(fā)人員的研究熱情，成為國內外研究的熱點［2－3］。本研究從苜蓿青貯、牛奶及奶酪、酸菜中的分離到4個可產生類細菌素菌株:戊糖乳桿菌、植物乳酸菌、戊糖片球菌、丙酸桿菌。并對其產類細菌素條件的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為其進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)基

苜蓿青貯、牛奶、酸菜、奶酪。分離株粗提發(fā)酵液。MRS、M17培養(yǎng)基，乳酸菌成套生化鑒定管(青島海博生物技術有限公司)，3%H2O2溶液。指示菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(塔里木大學預防獸醫(yī)學實驗室提供)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌分離鑒定

分離培養(yǎng)將苜蓿青貯、牛奶、酸菜、奶酪制備成10倍梯度稀釋液，吸取10－4、10－5和10－6三個稀釋度的稀釋液1ml于滅菌平皿中，向平皿中倒入適量 MRS、M17瓊脂培養(yǎng)基混勻冷卻后，放置在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取使培養(yǎng)基變黃的單菌落，在平板上劃線分離，經(jīng)革蘭氏染色，反復純化后保存斜面。

產乳酸的鑒定將分離菌株以接種于MRS、M17瓊脂液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48 h，得各菌株的發(fā)酵液。采用紙層析法定性測定乳酸［4］。

生化特性鑒定糖醇類發(fā)酵試驗。將分離菌株以接種于生化鑒定管中，放置在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，鑒定細菌的屬、種。

1.2.2 產類細菌素菌株的篩選

發(fā)酵液的制備將分離株純培養(yǎng)物接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，4℃離心15 min，上清液用濾膜過濾，除去菌體及其他雜質，得到發(fā)酵濾液。

紙片法預測抑菌效果將50片直徑為6 mm無菌濾紙片浸泡于0.5 ml發(fā)酵液中，過夜干燥后，分別測試對指示菌的抑菌效果。

H2O2、乳酸作用的排除［5］設3個不同處理發(fā)酵濾液:發(fā)酵液原液組，發(fā)酵濾液不做任何處理，測試對指示菌的抑制效果。排H2O2作用組，發(fā)酵濾液中加入等量10 mg/mL的過氧化氫酶液，30℃水浴60 min后對指示菌進行抑菌試驗。排乳酸作用組，將乳酸調無菌水pH與待測發(fā)酵濾液pH相同(pH=6.0)，分別測定乳酸水與發(fā)酵上清液對指示菌抑菌活性。

抑菌物質效價的測定采用牛津杯平板擴散法測試3個試驗組發(fā)酵濾液對指示菌的抑制效果［6］。將指示菌涂布接種于MRS或M17瓊脂平皿中，將發(fā)酵濾液吸取100 μL加入到牛津杯中，30℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的大小，并計算抑菌物質效價。

抑菌物質效價(Ru/mL)=(X－6)×1000/V

式中:X為抑菌圈直徑，mm;牛津杯直徑6 mm;V為樣品加入量，μL。

1.2.3 產細菌素條件的優(yōu)化

對生長的主要影響因素碳源、氮源和緩沖因子，具體為蛋白胨:牛肉膏:酵母提取物的質量比，碳氮總質量分數(shù)優(yōu)化進行調節(jié)，A組為常規(guī)配方，蛋白胨:牛肉膏:酵母提取物的質量比為2:2:1和碳氮總質量分數(shù)4.5%，B 組為1:1:1，4%，C為2:1:1，和5%，D組為2:1:1和6%，設計三因素正交實驗，以分離菌形成抑菌圈直徑的大小比較為評估依據(jù)，以得到優(yōu)化培養(yǎng)基。

表1 MRS培養(yǎng)基的成分變動表(重量g/100ml)

1.2.4 類細菌素的理化和生物學特性

以金黃色葡萄球菌為指示菌，按參考文獻［7］中的方法測試分離株發(fā)酵液的pH值敏感性、熱敏感性、蛋白酶敏感性。溫度試驗處理:分別在60℃、80℃、100℃加熱15 min。pH值試驗處理:發(fā)酵液調pH 至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。蛋白酶試驗處理:加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶，在30℃溫育2 h之后，將pH值調至6.0;對照為未經(jīng)處理的發(fā)酵液。30℃溫育反應，牛津杯法進行抑菌試驗。

2 結果

2.1 菌株分離、鑒定

經(jīng)分離純化得到3株菌球菌，6株桿菌革蘭氏陽性細菌。通過紙層析試驗，細菌發(fā)酵液與標準乳酸具有相近的Rf值0.72，可初步確定這9株細菌為乳酸菌。

結合細菌形態(tài)學及接觸酶試驗特性，對9分離菌株進行18種碳水化合物發(fā)酵利用特性研究，參考《伯杰氏鑒定細菌學手冊》［8］第8版及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》［9］，認為9株細菌是戊糖片球菌、木糖葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、模仿葡萄球菌(Staphylococci)、丙酸桿菌、異常芽孢桿菌(Abnormal Bacillus)、戊糖乳桿菌、植物乳酸菌、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、微小乳桿菌(Lactobacillus minor)。9株細菌生化特性結果見表2。

2.2 產類細菌素菌株的篩選

通過紙片法預測分離株發(fā)酵清液對指示菌的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用是戊糖乳桿菌、植物乳酸菌、戊糖片球菌、丙酸桿菌。分離株的抑制作用，可能是代謝物細菌素，也可能是H2O2、乳酸、乙酸等有機酸的存在，經(jīng)處理排除H2O2、乳酸的影響，將發(fā)酵上清液中和至pH值為6.0后，4株發(fā)酵液抑菌對金黃色葡萄球菌仍具有較強的抑菌活性，而乳酸抑菌作用不明顯，說明發(fā)酵液中除產生有機酸等抑菌物質外，還產生其他抑菌活性物質;經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵濾液的抑菌活性只有細微的變化，說明發(fā)酵液的抑菌效果并不是H2O2產生的。4株發(fā)酵液抑菌對大腸桿菌的抑菌活性較弱。

表2 9株細菌生化特性

表3 不同處理發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌作用試驗結果(直徑單位，mm)

表4 不同處理發(fā)酵液對大腸桿菌作用試驗結果(直徑單位，mm)

2.3 產類細菌素條件的優(yōu)化

經(jīng)過對分離株戊糖乳桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化后，在30℃(pH值為6.0)條件下，選擇C組碳氮質量分數(shù)為5%、碳氮質量比為3:2，MgSO4的添加量為0.07 g/100 ml，MnSO4的添加量為0.05 g/100 ml，0.2 ml/100 mlTween－80最有利于細菌素的產生，抑菌直徑可達18.2 mm，對金黃色葡萄球菌的作用效果是A組的1.2倍，D組高濃度的碳源、氮源、金屬離子對細菌素的活性物質的產生有一定的降低作用。

表5 不同配比MRS培養(yǎng)基對戊糖乳桿菌細菌素產量的影響(直徑單位，mm)

2.4 類細菌素的理化和生物學特性

經(jīng)不同溫度、pH處理后，發(fā)酵上清液的在高溫時仍有較強的抑菌能力，在pH為2.0～8.0的環(huán)境中對指示菌均有抑制作用，在 pH 3.0，4.0，5.0時較 pH 2.0，pH，6.0，pH7.0 時抑菌直徑大。發(fā)酵上清液被胰蛋白酶、胃蛋白酶作用后，對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用消失，說明該抑菌物質可能是蛋白質類物質。

表6 不同溫度、pH處理后的對金黃色葡萄球菌作用效果(直徑單位，mm)

3 討論

從不同生境中通過紙片法、牛津杯擴散法篩選出4株可產生抑菌活性的乳酸菌，將發(fā)酵上清液在中和到pH7.0，用過氧化氫酶，胰蛋白酶、胃蛋白酶，高溫處理仍保持活性表明其本質是蛋白質，但未做蛋白質的純化，故暫稱為類細菌素。80℃和100℃處理15 min后不能使其失活表明該物質有耐熱的特性。發(fā)酵上清液在pH3.0～8.0范圍內均有抑菌活性，在pH3.0～5.0范圍內穩(wěn)定性較好，抑菌物質對溫度不敏感，經(jīng)過蛋白酶的處理后抑菌活性有所降低。通常認為細菌素的抗菌譜通常較窄［10］，對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，而對革蘭氏陰性菌、酵母和霉沒有作用，而本實驗獲得的分離株抗菌物質對革蘭氏陰性細菌也具有一定抗菌活性，表明具有較寬的抑制譜，因而具有潛在的應用前景。

細菌素的產生與生長相聯(lián)系，有的細菌素在細胞剛開始生長時即有產生，而有的細菌素則在對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期才會產生［11］。培養(yǎng)基中碳氮比例對微生物生長繁殖和產物合成的影響極為顯著，氮源過多則會使菌體生長過于旺盛，容易引起菌體的衰老和自溶;碳源過多則容易形成較低的pH值，不利于菌體生長。Tween－80作為為一種乳化劑，可以降低菌體細胞與培養(yǎng)基接觸面之間的表面張力，從而改善細胞膜的通透性，減弱細胞對細菌素的吸附作用，使細菌素更多的釋放到培養(yǎng)基中，從而使細菌素產量增加。本次實驗通過對培養(yǎng)基成分調整以優(yōu)化產類細菌素的條件，實驗結果表明碳氮質量分數(shù)為 5%、碳氮質量比為 3:2，適量的 MgSO4，MnSO4，0.2 ml/100 mlTween－80對細菌素的產生都有一定的促進作用。

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