甲殼低聚糖的酶法制備及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用

王振偉，王哲嶸

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開封 475004）

0 引言

甲殼低聚糖是殼聚糖經(jīng)過物理方法、化學(xué)方法或者酶法降解后的低聚物，其分子量大小、分子量范圍以及乙?；鶜埢⒁阴；植嫉热Q于所用原料殼聚糖的種類、所采用的降解方法、所使用酶的特異性等。 目前，國(guó)內(nèi)外的研究大多關(guān)注殼聚糖的生物效應(yīng)，而對(duì)于其降解后的甲殼低聚糖的生物活性的分子作用機(jī)制、精細(xì)化制備及應(yīng)用等的研究相對(duì)較少。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲殼低聚糖應(yīng)用在醫(yī)藥中時(shí)，可以作為抗哮喘藥物、抗菌劑、傷口敷料組成成分和基因治療的緩釋載體，它還可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散， 提高骨質(zhì)疏松癥患者的骨強(qiáng)度，預(yù)防瘧疾等[1]。 同時(shí)，甲殼低聚糖還有免疫調(diào)節(jié)作用，富有抗真菌活性，能夠有效降低肝臟和血清中的膽固醇、血壓、血糖和血脂等[2～3]。 本文著重研究目前甲殼低聚糖的酶制備方法、降解產(chǎn)物的分離純化與表征，及甲殼低聚糖在醫(yī)藥中的應(yīng)用等。

1 酶法制備甲殼低聚糖分析

甲殼低聚糖的制備包括物理法、化學(xué)法和酶法，以及由這些方法派生出的適合實(shí)際生產(chǎn)的復(fù)合法等。 物理法和化學(xué)法對(duì)殼聚糖的降解有一定的作用，但會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染，產(chǎn)物分子量不易控制，還可能引起交聯(lián)和歧化反應(yīng)等，難以得到較純的甲殼低聚糖。 與物理、化學(xué)降解方法相比，酶法制備甲殼低聚糖具有許多優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)條件溫和，可選擇性地切斷β-1,4 糖苷鍵，反應(yīng)過程不需要大量試劑，降解產(chǎn)物分子量易于控制，制備的甲殼低聚糖生物活性高等。 同時(shí)，通過改變使用的酶的種類及組合，可以得到所需分子量范圍的低聚糖。 目前，用于降解殼聚糖的酶分為專一性用酶和非專一性用酶兩類。

1.1 專一性酶降解法

在專一性酶中，被研究較多的是殼聚糖酶。 這種酶主要來源于真菌，在植物組織中也有分布。 殼聚糖酶水解底物作用化學(xué)鍵位點(diǎn)不同，導(dǎo)致降解產(chǎn)物聚合度的不同， 其最適宜的pH 值為4.0～6.8，產(chǎn)物多是聚合度為2～8 的低聚糖。 如BacilluscereusS1 來源殼聚糖酶水解底物產(chǎn)生的甲殼低聚糖聚合度為2～4，主要是三聚體；Miyake 等[4]用牙孢桿菌屬產(chǎn)生的脫乙酰殼聚糖酶在50℃下降解10 h，得到了聚合度為8 的甲殼低聚糖，而Rhodotorulagracilis來源的殼聚糖酶催化產(chǎn)生的產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為9500[5]。 不同來源的殼聚糖酶除了水解位點(diǎn)不同外，其最適宜溫度（30℃～80℃）差別也較大。

甲殼素酶也是一類重要的專一性用酶，包括甲殼素外切酶、內(nèi)切酶及β-N-乙酰氨基葡萄糖酶。 甲殼素酶在發(fā)生作用時(shí)，先由降解酶催化水解甲殼素的糖苷鍵。 外切酶以甲殼二糖為單位，從甲殼素的非還原端開始酶切；內(nèi)切酶則隨機(jī)水解糖苷鍵。 同時(shí)， 外切酶水解成的甲殼二糖被β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解成單糖。 一些β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也有較弱的外切酶活性，從甲殼素的非還原端開始直接水解成單糖。

溶菌酶是另一類被研究比較多的專一性用酶。溶菌酶除了能夠水解某些細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖外，也能夠水解甲殼素和殼聚糖。 在早期的研究中，Amano and Ito 等人[6]研究了溶菌酶降解殼聚糖分離，得到了完全N-乙?；娜垠w和四聚體。

1.2 非專一性酶降解法

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多種酶對(duì)殼聚糖具有非專一性水解作用,也可用來催化水解殼聚糖，得到相對(duì)分子量較低的產(chǎn)品。 非專一性酶價(jià)廉易得，因而就成為近年來制備甲殼低聚糖的研究熱點(diǎn)。 采用非專一性酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，酶種不同，降解速度也不同。 從作用效果來看，雖然各類非專一性酶似乎并不存在共同的催化基團(tuán)，但大都能制備水溶性的低分子質(zhì)量的殼聚糖。 陳江燕等研究了纖維素酶對(duì)殼聚糖的降解作用，得到的水解產(chǎn)物有氨基葡萄糖和它的二糖、三糖和四糖[7]。 胃蛋白酶降解殼聚糖得到的主要是平均聚合度為16 的甲殼低聚糖[8]。 何新益等使用由蛋白酶、果膠酶、纖維素酶組合而成的復(fù)合酶水解殼聚糖，得到了相對(duì)分子量低于4 000 的甲殼低聚糖。

1.3 不同酶降解殼聚糖的效果比較

專一性酶和非專一性酶制備甲殼低聚糖各有優(yōu)缺點(diǎn)，其作用方式、產(chǎn)物性質(zhì)等各有不同。 兩種酶降解方式及效果比較如表1 所示。

表1 專一性酶和非專一性酶降解效果比較Table 1 Comparison of specific enzyme and non-specific enzyme degradation effect

自然界中的殼聚糖絕大部分由甲殼素酶和殼聚糖酶催化水解成小分子。 但是，商品化的殼聚糖酶的價(jià)格昂貴,不易得到，限制了專一性殼聚糖酶的應(yīng)用。 非專一性酶法能制備水溶性相對(duì)分子質(zhì)量低的殼聚糖，但也存在著生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生理生化活性低、酶添加量較多等缺點(diǎn)。 不過，與其他降解方法相比，酶法仍是最理想的降解方法。

2 甲殼低聚糖的純化與表征分析

2.1 產(chǎn)物的分離純化

由酶法制備的甲殼低聚糖通常是在一定分子量分布范圍內(nèi)的低聚物混合物，需要采用一些技術(shù)手段加以分離、純化，從而得到單一分子量或一定分子量范圍內(nèi)較純的甲殼低聚糖。 酶法制備的甲殼低聚糖分離純化技術(shù)包括調(diào)節(jié)體系的pH 值、過濾、離心、透析、真空（或冷凍）干燥發(fā)揮等。 在一般情況下，這些技術(shù)手段需要組合起來、共同發(fā)揮作用，才能獲得較為均勻的甲殼低聚糖片段。 盡管在甲殼低聚糖純化方面取得了一些成功，但生產(chǎn)純的低聚糖仍然是一個(gè)耗時(shí)較多而且具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。

依據(jù)甲殼低聚糖相對(duì)分子量的大小，最常見的制備分離方法是分子排阻色譜法（SEC）。最近，已經(jīng)描述了聚合度為40 的低聚糖的分離方法。 用于制備甲殼低聚糖的排阻色譜系統(tǒng)所用的是Superdex30柱，示差折光檢測(cè)器可以檢測(cè)到制備的低聚物[8]。

甲殼低聚糖的進(jìn)一步分離可以采用陽(yáng)離子交換層析法，因?yàn)槊撘阴：蟮奶堑馁|(zhì)子化氨基集團(tuán)可以與離子交換材料相互作用。 此方法可以獲得相同聚合度的甲殼低聚糖。 在其他的方法中，金屬離子親和層析法已成功地用于分離較短片段的甲殼低聚糖。

2.2 甲殼低聚糖產(chǎn)物的表征

高效液相色譜（HPLC）可用來鑒定殼聚糖的降解產(chǎn)物，凝膠滲透色譜（GPC）可測(cè)定甲殼低聚糖分子量及其分布。 陳江燕等用HPLC 研究殼聚糖降解物， 分析結(jié)果說明， 在保留時(shí)間6.142 min、6.181 min、7.183 min、8.162 min 4 處出現(xiàn)峰， 分別是氨基葡萄糖的單糖、二糖、三糖和四糖[7]。 另外，紙層析、紫外吸收光譜、核磁共振分析（NMR）、基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI TOF MS）等技術(shù)也常用于甲殼低聚糖的表征[9]。

3 甲殼低聚糖在醫(yī)藥中的應(yīng)用

甲殼低聚糖應(yīng)用在醫(yī)藥中的主要作用是可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度，用于基因治療，抵抗細(xì)菌浸染，加快傷口愈合等。

3.1 抑制腫瘤生長(zhǎng)

關(guān)于甲殼低聚糖的抗腫瘤作用的報(bào)道最早出現(xiàn)在20 世紀(jì)70 年代。 有證據(jù)證明，甲殼低聚糖在減少腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有積極的作用。 Maeda and Kimura 等人的[10]研究發(fā)現(xiàn)，甲殼低聚糖能夠提高淋巴細(xì)胞的殺傷活性，減少小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。 這表明，甲殼低聚糖所具有活化腸道免疫系統(tǒng)的功能能夠用于治療腫瘤。

甲殼低聚糖能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。 最近幾年，有關(guān)甲殼低聚糖抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的研究也得到了更多的關(guān)注。 血管生成是指從已有的血管形成新的毛細(xì)血管。 由于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移需要血管提供營(yíng)養(yǎng)，沒有血管供血，腫瘤不會(huì)長(zhǎng)大。 所以，抗腫瘤生長(zhǎng)在腫瘤治療中有極其重要的價(jià)值。 Xiong C.等[11]比較了完全脫乙?；募讱さ途厶堑亩垠w和六聚體對(duì)血管生成的影響，發(fā)現(xiàn)六聚體是血管生成最有效的抑制劑。 而Wang S L 等人[12]的研究則表明，與N-乙?；募讱さ途厶窍啾?，完全脫乙?；募讱さ途厶菬o論是在體外還是在體內(nèi)都能更有效地防止血管生成。

3.2 增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成軟骨細(xì)胞 （軟骨）、脂肪細(xì)胞（脂肪）和成骨細(xì)胞（骨）。 成骨細(xì)胞生成類骨質(zhì)，并進(jìn)一步礦化，產(chǎn)生骨基質(zhì)。 骨組織主要由骨基質(zhì)和成骨細(xì)胞構(gòu)成。 殼聚糖和甲殼低聚糖增加成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)骨組織的形成。 有充分證據(jù)證明，甲殼低聚糖能夠增加鈣沉積于骨骼里的比例。Jung 等人[13]發(fā)現(xiàn)，甲殼低聚糖可以有效地抑制磷酸鈣鹽的形成，從而增加鈣的生物利用度和骨強(qiáng)度。 他們還發(fā)現(xiàn)，甲殼低聚糖（＜5kDa）能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松型大鼠的骨鈣沉積，抑制破骨細(xì)胞活性，從而抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換。在Ca2+不足的條件下，如在骨質(zhì)疏松癥中，甲殼低聚糖可能會(huì)作為鈣強(qiáng)化劑，產(chǎn)生有益的作用[14]。

3.3 基因治療

1995 年，殼聚糖就作為靶向基因的載體，用于基因治療。 殼聚糖與質(zhì)粒DNA 形成穩(wěn)定的配合物，可以用作黏膜組織（如肺）和腸上皮細(xì)胞中基因給藥的載體[15]。但是，高分子量的殼聚糖存在著在生理pH 條件下溶解度低的缺點(diǎn)。 通過使用甲殼低聚糖而不是殼聚糖， 可能會(huì)克服這些缺點(diǎn)。 K?ping-H?gg?rd 等人的研究[16]表明，完全脫乙?；募讱さ途厶牵ň酆隙葹?4）無論是在體外還是體內(nèi)，均能夠與質(zhì)粒DNA 形成穩(wěn)定的復(fù)合物。 據(jù)推測(cè)，甲殼低聚糖-DNA 復(fù)合體在pH 值約為6 時(shí)的不穩(wěn)定性與在pH 值高于7 時(shí)的穩(wěn)定性之間存在著微妙平衡，是其具有高效率的原因。

3.4 抵抗細(xì)菌浸染

甲殼低聚糖的抗感染作用已經(jīng)被許多學(xué)者所證實(shí)。 關(guān)于其作用的機(jī)制，有以下幾種解釋：（1）將巨噬細(xì)胞直接激活，從而增加其殺傷活性。 （2）激活T 淋巴細(xì)胞，而顯示殺傷活性，且致敏T 細(xì)胞誘發(fā)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。 （3）激活T 淋巴細(xì)胞。 T 淋巴細(xì)胞能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞激活因子的釋放，從而激活巨噬細(xì)胞，增加殺傷活性[17]。 甲殼低聚糖含有N-乙酰-D-糖胺（GlcNAc）或D-糖胺（GLcN）基團(tuán)，一些免疫細(xì)胞表面含有Glc-NAc 或GLcN 殘基受體，當(dāng)這些受體與殼聚糖結(jié)合后，可活化免疫細(xì)胞。 Tokoro 等人的研究[18]發(fā)現(xiàn)，甲殼低聚糖通過細(xì)胞免疫功能而對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌具有很強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用。

3.5 傷口敷料

甲殼低聚糖具有加速傷口愈合的積極作用。 殼聚糖作為硬組織激發(fā)劑，具有固定肝素、硫酸軟骨素和葡聚糖的功能，可以有效地刺激硬組織，尤其是骨組織的恢復(fù)和再生，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷的愈合。 殼聚糖可由天然存在的酶降解為甲殼低聚糖，其觀察到的活性，實(shí)際上很可能是由酶降解后產(chǎn)生的甲殼低聚糖引起的[19]。因此，使用生物利用度更好的甲殼低聚糖作為傷口敷料，可以得到更直接的治療效果。 甲殼低聚糖被認(rèn)為是具有加強(qiáng)炎癥和修復(fù)細(xì)胞的功能，從而能夠加速傷口愈合。

殼聚糖與甲殼低聚糖的止血效果也可能有助于傷口愈合。 殼聚糖能夠增強(qiáng)血小板的黏附和聚集， 從而增加血液中血小板衍生生長(zhǎng)因子AB（PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的釋放[20]。在傷口愈合過程中，這兩個(gè)生長(zhǎng)因子被認(rèn)為是很重要的炎癥細(xì)胞。 完全脫乙?；募讱さ途厶窃谥委焸谏陷^為有效， 因?yàn)樵从贒-糖胺給了膠原酶最高活性，而膠原酶主要由成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，其活性的高低與傷口愈合直接相關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

甲殼低聚糖具有重要的生理活性，且能克服殼聚糖在中性溶液中難以溶解的缺點(diǎn)，市場(chǎng)潛力巨大。近年來， 它受到相關(guān)領(lǐng)域研究人員的廣泛重視，他們?cè)诿阜ㄉa(chǎn)菌株的篩選或重組表達(dá)、反應(yīng)催化劑選擇、酶法降解底物特性、用物理化學(xué)方法降解產(chǎn)物性質(zhì)等方面進(jìn)行了諸多研究。 隨著研究的逐步深入，甲殼低聚糖具有廣泛的生物活性這一點(diǎn)已經(jīng)得到充分的證實(shí)，下一步的研究方向?qū)?huì)是甲殼低聚糖制劑的精細(xì)化制備及其生物活性的分子作用機(jī)制。

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