玉屏銀屑方對濕熱證型銀屑病動物模型T淋巴細(xì)胞亞群的影響

★ 王玉芝（山東中醫(yī)藥大學(xué) 濟(jì)南250014）

大量研究證實銀屑病早期皮損以CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤為主，而慢性皮損則以CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤為主[1]。本實驗制造了濕熱證型銀屑病病證結(jié)合動物模型，并在造模同時預(yù)防性應(yīng)用玉屏銀屑方，通過應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組實驗動物CD4+∕CD8+比值，來觀察預(yù)防性應(yīng)用玉屏銀屑方對造模動物細(xì)胞免疫功能的影響。

1 實驗方法

1.1 材料與方法

1.1.1 動物與分組 動物：純白哈德萊普通級豚鼠70 只，體重230g-250g，雌雄不限，濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，合格證號：SCXK 魯20100005。分組：70 只豚鼠隨機分為4 個組，正常對照組（Ⅰ組）10 只、銀屑病組（Ⅱ組）20 只，濕熱證型銀屑病造模組（Ⅲ組）20只，玉屏銀屑方組（Ⅳ組）20只。

1.1.2 主要試劑和儀器Mouse anti-Rat PC5-CD3，F(xiàn)ITC-CD4，PE-CD8 由BD Pharmlgen 公司提供；氣候模擬倉由濟(jì)南昊昱溫室工程公司按照實驗要求尺寸定做；病理標(biāo)本采集分析工作由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科協(xié)助完成。

1.1.3 主要藥物 心得安，山西制藥有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號：B120405；乳劑基質(zhì)由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科提供；按要求配制成5%心得安乳劑備用。玉屏銀屑方組成：黃芪20g，白術(shù)10g，防風(fēng)10 g，金銀花20 g，柴胡10 g，土茯苓20 g，薏苡仁30 g，車前草30 g，白花蛇舌草20 g，板藍(lán)根20 g，紫草10 g，生地20 g，丹皮10 g，赤芍10 g，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。煎制法：將藥物洗凈切碎，加水浸泡1 小時后，水煎2 次，合并其濾液，取煎液約100mL，濃度為2.4mg∕mL，置4℃冰箱中冷藏備用。紅星二鍋頭酒（酒精度為55度），蜂蜜、豬油等市售。

1.2 動物模型制作方法

1.2.1 正常對照組（Ⅰ組）：標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水及自然環(huán)境飼養(yǎng)6周。

1.2.2 銀屑病組（Ⅱ組）：采用黃畋法[2]制造豚鼠耳部的銀屑病樣動物模型。即：標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水及自然環(huán)境飼養(yǎng)3 周，自第4 周開始與Ⅲ組同時，以5%心得安乳劑均勻涂于豚鼠耳背（1cm2用藥0.3g，涂勻），每日3 次，厚度為1.0mm，連續(xù)3 周。作為與Ⅳ組對照，從第2周開始給于生理鹽水灌胃，1mL，1日1次，共5周。

1.2.3 濕熱證型銀屑病造模組（Ⅲ組）：濕熱環(huán)境+高脂高糖飲食+白酒+涂藥。造模豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，第2 周開始在標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加用200g∕L蜂蜜水自由飲用，并按豚鼠體質(zhì)量灌服油脂10g∕kg，2 日1 次，并與油脂隔日灌服10mL∕kg 白酒，共2周后，以心得安乳劑外涂豚鼠雙耳背皮膚（同Ⅱ組）3 周，并自涂藥當(dāng)天起隔日放入溫度為（32±2）℃，相對濕度為（95±5）%的人工氣候箱中，共3次，每次3小時。亦從第2周起用生理鹽水灌胃，共5周。

1.2.4 玉屏銀屑方組（Ⅳ組）造模方法與Ⅲ組相同，造模同時給予玉屏銀屑方灌胃。造模豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照人與動物公斤體重比值進(jìn)行藥物劑量的折算[3]每天給予玉屏銀屑方1.5mL，灌胃，至造模結(jié)束共5 周，同時給予高脂高糖飲食加白酒2周后，耳背涂藥3周并隔日放入氣候箱3次。

1.3 檢測、觀察指標(biāo)

1.3.1 主要癥狀、體征的觀察 注意觀察各組豚鼠的一般情況、飲食、二便、毛發(fā)及耳背皮膚的變化等情況。監(jiān)測各組豚鼠的直腸溫度及體重的變化。

1.3.2 病理標(biāo)本采集 造模結(jié)束后，禁食12小時，自由飲水，豚鼠麻醉后，迅速取下耳部標(biāo)本，置于10%甲醛溶液中固定，進(jìn)行病理制作、Baker法組織評分和炎癥細(xì)胞計數(shù)。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測各組動物CD4+∕CD8+比值 在山東省醫(yī)科院進(jìn)行，造模結(jié)束后，腹主動脈取血，置入EDTA抗凝管，然后進(jìn)行樣品的制備，上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 主要癥狀、體征的觀察

2.1.1 一般情況 死亡情況：Ⅲ組、Ⅳ組因灌胃不當(dāng)，分別死亡2只、3只。Ⅱ組動物自造模1周后出現(xiàn)精神差，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少，體重增長放緩，毛發(fā)無光澤、易脫落，肛溫正常。3周后上述癥狀加重同時出現(xiàn)搔抓耳部現(xiàn)象。Ⅲ組動物造模前期體重增長較快，精神正常，后期放人工氣候箱以后體重增長變緩，并有部分豚鼠體重減輕，納呆少飲，嗜睡懶動，大便時干時溏，肛溫升高明顯。Ⅳ組動物與Ⅲ組相比，耐受濕熱能力增強，體重下降出現(xiàn)較晚，嗜睡、納呆、便溏等癥狀較輕。

2.1.2 豚鼠雙耳外觀皮膚形態(tài)Ⅱ組豚鼠涂藥2 周后，毛發(fā)部分脫落無毛根，部分耳背毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯；3周后7只動物耳背皮膚紅腫，覆蓋著少量脆屑樣細(xì)小銀白色鱗屑。Ⅲ組豚鼠耳背皮膚銀屑病樣模型出現(xiàn)的更早更典型：5只豚鼠涂藥3-5天，即出現(xiàn)耳背毛發(fā)部分脫落無毛根，耳背毛細(xì)血管擴(kuò)張，其余13 只在涂藥6-7 天開始出現(xiàn)同樣改變；涂藥2周后，皮損紅腫，部分豚鼠覆蓋著少量脆屑樣細(xì)小銀白色鱗屑，；3周后12只鱗屑增多，已呈現(xiàn)典型的銀屑病樣皮損。Ⅳ組癥狀較Ⅲ組明顯出現(xiàn)的晚：平均涂藥12 天后，耳背毛發(fā)部分脫落無毛根，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯；3 周后8 只覆蓋著少量脆屑樣細(xì)小銀白色鱗屑，出現(xiàn)典型銀屑病癥狀。

2.2 豚鼠耳背皮膚病理學(xué)改變

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組鏡下均出現(xiàn)典型銀屑病病理表現(xiàn)，其中Ⅱ組2 例、Ⅲ組4 例、Ⅳ組2 例，角化不全部位可見Munro小膿瘍；顆粒層變薄或消失。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理Baker評分及炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組均顯著高于Ⅰ組，Ⅱ組與Ⅲ組比較亦出現(xiàn)差異性，Ⅲ組評分高于Ⅱ組，而Ⅳ組評分低于Ⅲ組（見表1）。

表1 各組豚鼠Baker 評分及炎癥細(xì)胞浸潤情況評估

2.3 各組實驗動物CD4+∕CD8+比值

（1）CD4+方面：Ⅱ組、Ⅲ組均高于Ⅰ組（P＜0.05），說明銀屑病進(jìn)展期CD4+顯著升高，而Ⅳ組比Ⅰ組亦升高但無統(tǒng)計學(xué)意義；（2）CD8+方面：各組均無顯著性差異；（3）CD4+∕CD8+比值：Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與Ⅰ組比較均顯著增高（P＜0.05），且Ⅲ組顯著高于Ⅱ組，而Ⅳ組比Ⅲ組有明顯下降（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組實驗動物CD4+∕CD8+比值

3 討論

玉屏銀屑方乃山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科杜錫賢教授的經(jīng)驗方，多用于銀屑病患者臨床治愈或穩(wěn)定后的鞏固治療，可延緩或減少銀屑病的復(fù)發(fā)，王建青博士已在臨床研究中給以證實[4]。杜教授將銀屑病纏綿難愈和易復(fù)發(fā)的原因總結(jié)為“三久一固”：久病多虛，久病多濕，久病多瘀，固疾多毒。而本方扶正祛邪兼顧，針對銀屑病復(fù)發(fā)的病因，起到調(diào)節(jié)免疫，從而防止復(fù)發(fā)的效果。

本實驗造模結(jié)束時觀察到，銀屑病與濕熱證的病證結(jié)合模型同時出現(xiàn)嗜睡懶動，納呆少飲，大便時干時塘，肛溫升高，血脂升高等典型的濕熱證表現(xiàn)和耳背皮膚典型銀屑病樣表現(xiàn)；且其銀屑病癥狀較單純心得安外涂組出現(xiàn)的更早、更典型，病理評分亦增高；同時CD4+∕CD8+比值也比銀屑病組有顯著性升高。而預(yù)防性應(yīng)用玉屏銀屑方組與濕熱證型銀屑病動物模型組相比則有效減緩了銀屑病癥狀的出現(xiàn)，組織病理Baker 評分和炎癥細(xì)胞浸潤也有顯著降低。在免疫方面發(fā)現(xiàn)CD4+∕CD8+的比值顯著降低，其中主要以調(diào)節(jié)CD4+水平為主。目前國內(nèi)外關(guān)于銀屑病檢測T 淋巴細(xì)胞亞群的報道很多，但結(jié)果并不一致，本研究發(fā)現(xiàn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展早期可能與CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤有關(guān)。

通過本實驗充分說明了濕熱因素在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用，證實了杜錫賢教授的“皮膚病濕熱潛證”的觀點，另一方面也驗證了玉屏銀屑方在預(yù)防銀屑病效果切實可靠。同時為了便于患者的長期預(yù)防用藥，我們多改用免煎中藥來保證療程，同時配合認(rèn)知行為干預(yù)及放松訓(xùn)練，使銀屑病真正成為一種可防、可治、可控的疾病，從而增強患者戰(zhàn)勝疾病的信心。

[1]Onuma S Imm unoh is tochem ical studies of infiltrating cells in early and chronic of psoriasis[J].Dem atol，1994，21（4）：223-232.

[2]黃畋，張淑芝，孫令.普萘洛爾涂藥造成豚鼠耳部銀屑病樣病理變化[J].中華皮膚科雜志，1991，24：96-97.

[3]施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2001，第1版：332-335.

[4]王建青.治未病理論在復(fù)發(fā)型尋常型銀屑病防治中的應(yīng)用研究[D].山東中醫(yī)藥大學(xué)2011屆博士研究生學(xué)位論文.