重組原核表達(dá)載體p QE－30－luxS的構(gòu)建與表達(dá)

趙日紅，孟祥晨，* ，滿麗莉，2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院，黑龍江牡丹江157041)

luxS基因是大多數(shù)細(xì)菌基因中相對(duì)保守的一段序列，編碼產(chǎn)物L(fēng)uxS是AI-2合成的關(guān)鍵酶。Fuqua等首次提出“群體感應(yīng)”這個(gè)術(shù)語(yǔ)，用其來(lái)描述細(xì)菌細(xì)胞特定形式的分子交流［1］，并把群體感應(yīng)系統(tǒng)涉及的一種通用信號(hào)分子稱為AI-2?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)50多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌［2］具有l(wèi)uxS的同源序列，且同源性很高，分泌的信號(hào)分子AI-2結(jié)構(gòu)相似，LuxS/AI-2介導(dǎo)的種群間群體感應(yīng)系統(tǒng)是最常見的一種群體感應(yīng)系統(tǒng)。在不同的細(xì)菌中，LuxS/AI-2介導(dǎo)的種群間群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌的生理生化功能不同。在溶血性大腸桿菌中，luxS基因的突變導(dǎo)致AI-2合成量減少，使Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達(dá)量降低［3］。在變異鏈球菌中LuxS/AI-2調(diào)控其對(duì)酸、氧化等壓力的耐受以及細(xì)菌素的合成［4］。伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)等細(xì)菌都可以不同程度的表達(dá)LuxS蛋白并合成信號(hào)分子AI-2，從而對(duì)細(xì)菌毒力牙菌斑的形成發(fā)揮重要的調(diào)控作用［5-6］;大腸桿菌也被證實(shí)可以表達(dá)LuxS蛋白并合成高活性AI-2［7-8］。大腸桿菌是目前研究深入并被廣泛使用的原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，主要優(yōu)勢(shì)是容易培養(yǎng)且易于控制基因表達(dá)，可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。本項(xiàng)目組前期研究證明植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素的合成受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，本研究主要利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)LuxS蛋白，為進(jìn)一步研究AI-2如何調(diào)節(jié)植物乳桿菌KLDS1.0391的細(xì)菌素合成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

測(cè)序載體p MD18-T simple(含有氨芐青霉素抗性基因)、植物乳桿菌KLDS1.0391、大腸桿菌JM109本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)質(zhì)粒p QE-30 黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)郭東華老師惠贈(zèng);大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞 上海顯益化學(xué)科技有限公司;MRS培養(yǎng)基 用于植物乳桿菌KLDS1.0391液體以及固體培養(yǎng);LB培養(yǎng)基 用于大腸桿菌JM109和M15液體以及固體培養(yǎng);PrimeSTARHS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶HindⅢ(15U/μL)、KpnⅠ(10U/μL)、T4DNA Ligase、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒

TaKaRa公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒 購(gòu)自天根生化科技有限公司;卡那霉素(Kana)、氨芐青霉素(Amp)，二硫蘇糖醇(DTT) 購(gòu)自哈爾濱鑫豐生物材料有限公司;IPTG 購(gòu)自哈爾濱賽拓生物科技有限公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、SDS、Tris Sigma公司;其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純;PCR引物

根據(jù)植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)用于大量擴(kuò)增目的基因的引物，上 游 引 物 P1:5′-GGGGTACCATGGCTAAA GTAGAAAGTT-3′，下游引物 P2:5′-CCCAAGCTT CTATTCAACGACTTTGCGT-3′，其中在上下游引物中分別增加KpnⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

UVP凝膠成像系統(tǒng)儀 美國(guó)UVP公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;蛋白電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;ZHWY200B型全溫度恒溫培養(yǎng)搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;CHB-100恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

pQE-30-luxS重組質(zhì)粒構(gòu)建的技術(shù)路線圖如圖1。

圖1 pQE-30-luxS重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant prokaryotic vector pQE-30-luxS

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增及純化 以植物乳桿菌KLDS1.0391基因組DNA為模板，用引物P1和P2擴(kuò)增luxS基因。PCR擴(kuò)增體系為50μL，反應(yīng)體系為:上下游引物(10μmol/L 2μL，DNA 模板1μL，5 ×PCR緩沖液(含 Mg2+)10μL，dNTP(各 2.5mmol/L)4μL，PrimeSTARHS DNA Polymerase 0.5μL， dd H2O 30.5μL)。PCR反應(yīng)過(guò)程如下:94℃預(yù)變性 3min，94℃變性30s，63℃退火45s，72℃延伸90s，共循環(huán)35次，72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收獲得目的基因。

1.2.2 目的基因與測(cè)序載體連接及轉(zhuǎn)化 由于PrimeSTAR HS DNA Polymerase擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為平末端，為連接PCR產(chǎn)物與載體p MD18-T simple，需在PCR產(chǎn)物3′端加A。3′端加A并純化后的目的片段和載體pMD18-T simple按摩爾比10∶1混合，16℃過(guò)夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18-T simpleluxS，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中。

1.2.3 重組質(zhì)粒p MD18-T simple-luxS的篩選及鑒定 挑取單個(gè)菌落，以菌體為模板，P1/P2為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。挑取正確菌落于含有60μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃下100r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒并用KpnⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的陽(yáng)性克隆菌液送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與正確的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 目的基因與表達(dá)載體連接與轉(zhuǎn)化 提取重組質(zhì)粒 pMD18-T simple-luxS，以KpnⅠ和HindⅢ進(jìn)行分步酶切，回收l(shuí)uxS基因。再與經(jīng)過(guò)雙酶切的表達(dá)載體p QE-30按摩爾比10∶1混合，16℃過(guò)夜連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-30-luxS，轉(zhuǎn)化到E.coliM15中。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒p QE-30-luxS的篩選及鑒定挑取單個(gè)菌落為模板，P1/P2為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。挑取正確菌落于含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 100r/min過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒用KpnⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的陽(yáng)性克隆菌液送往華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與正確的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 重組LuxS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析［9-10］將含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E.coliM15單克隆接種到含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基中，37℃ 100r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取過(guò)夜培養(yǎng)物200μL加入到1800μL LB培養(yǎng)基中，并使Amp和 Kana的終濃度為 100μg/mL和 25μg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)約1h(OD600=0.4～0.6)，加入1mmol/L IPTG誘導(dǎo)，37℃振蕩培養(yǎng)3.5h，期間每半小時(shí)取樣一次，離心收集菌體，PBS洗滌菌體2次，以未誘導(dǎo)樣品為空白對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液進(jìn)行染色分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 luxS基因的擴(kuò)增

以植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因序列為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出的DNA片段在約500bp處形成單一的條帶(圖2)，與預(yù)計(jì)片斷大小一致。

2.2 PCR產(chǎn)物純化

為滿足后續(xù)酶切反應(yīng)的要求，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，再經(jīng)3′端加A并純化后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得與PCR產(chǎn)物大小一致的單一目的條帶(圖3)。

圖2 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplication of the target gene

圖3 目的基因PCR產(chǎn)物的純化Fig.3 Purification of PCR products of the target gene

2.3 重組質(zhì)粒p MD18－T simple－luxS的鑒定

純化后的目的基因與測(cè)序載體pMD18-T simple過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中，通過(guò)含有60μg/mL Amp的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，發(fā)現(xiàn)抗性平板上長(zhǎng)出少量單菌落(圖4)。

圖4 重組轉(zhuǎn)化子pMD18-T simple-luxS的篩選Fig.4 Screening for the combinated strain with plasmid pMD18-T simple-luxS

隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果表明:PCR產(chǎn)物大小與目的基因一致，約500bp(圖5)。

提取質(zhì)粒并用KpnⅠ和HindⅢ進(jìn)行分步酶切鑒定。由于線性p MD18-T simple大小約為2700bp，目的基因約500bp，重組質(zhì)粒的理論長(zhǎng)度約3200bp(圖6)。如圖7所示，酶切獲得兩條正確的目的條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒正確，連接轉(zhuǎn)化成功，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18-T simple-luxS，并將重組質(zhì)粒送往華大基因進(jìn)行測(cè)序。本課題前期對(duì)植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因已進(jìn)行測(cè)序，且在GenBank上的序列號(hào)為HQ704889，重組質(zhì)粒p MD18-T simple-luxS的測(cè)序結(jié)果與已知序列相似度達(dá)100%(比對(duì)結(jié)果略)，完全相同，因此判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of positive clones

圖6 KpnⅠ第一步酶切結(jié)果Fig.6 Enzyme digestion result of pMD18-T simple-luxSby KpnⅠ

圖7 HindⅢ第二步酶切結(jié)果Fig.7 Enzyme digestion result of pMD18-T simple-luxSby HindⅢ

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pQE－30－luxS的構(gòu)建

表達(dá)質(zhì)粒p QE-30經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，結(jié)果如圖8所示。將重組質(zhì)粒pMD18-T simple-luxS分步酶切后回收l(shuí)uxS基因，將兩種回收產(chǎn)物過(guò)夜連接。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliM15中，通過(guò)含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。如圖9所示，平板上長(zhǎng)出少數(shù)單菌落。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果見圖10。

提取質(zhì)粒，用KpnⅠ第一步酶切，得到目的片段約4000bp，與預(yù)計(jì)相符，然后用HindⅢ進(jìn)行第二步酶切，獲得大小分別約為3500bp和500bp的兩個(gè)目的片段，結(jié)果如圖11所示。將鑒定正確的菌液送往華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已知序列(GenBank序列號(hào)為HQ704889)相似度達(dá)到100%，完全相同，因此判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖8 質(zhì)粒pQE30雙酶切結(jié)果Fig.8 Identification of restrict product of pQE-30

圖9 重組轉(zhuǎn)化子pQE-30-luxS的篩選Fig.9 Screening for the combinated strain with plasmid pQE-30-luxS

圖10 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定Fig.10 PCR identification of positive clones

圖11 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.11 Recombinant plasmid and identification of two enzyme digestion

2.5 luxS基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE鑒定

含pQE-30-luxS的E.coliM15于37℃經(jīng)100r/min振蕩培養(yǎng)1h后，加入1mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3.5h后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖12所示。重組菌泳道增加一條約17.4ku的蛋白條帶，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白表達(dá)量越多，與LuxS蛋白大小吻合，而未誘導(dǎo)菌在此處無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)條帶。

圖12 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳鑒定Fig.12 Identification of recombinant expressed protein by SDS-PAGE

3 討論

luxS基因普遍存在且同源性很高，編碼的蛋白對(duì)AI-2的合成起重要的催化作用。研究發(fā)現(xiàn)在體外可以用純化的 LuxS蛋白和Pfs蛋白催化 SAH(S-腺苷高半胱氨酸)產(chǎn)生高 活性的 AI-2［11］。Schauder等擴(kuò)增E.coliMG1655中的luxS基因和pfs基因，并與表達(dá)載體pGEX-4T-1連接，成功表達(dá)LuxS蛋白和 Pfs蛋白，并體外合成 AI-2［12］。Sperandio等擴(kuò)增E.coliMG1655的luxS基因和pfs基因，并與表達(dá)載體pQE-30連接，成功表達(dá)LuxS蛋白和Pfs蛋白，合成高效的AI-2［13］。Li等擴(kuò)增表皮葡萄球菌的luxS基因和pfs基因，應(yīng)用表達(dá)載體pQE-9和pGEX-4T-1分別表達(dá)LuxS蛋白和Pfs蛋白，并體外合成AI-2［14］。以上文獻(xiàn)通過(guò)測(cè)定AI-2的生物活性發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)LuxS蛋白或Pfs蛋白與SAH作用，AI-2生物活性不明顯，但二者同時(shí)與SAH反應(yīng)后可產(chǎn)生高活性的AI-2，說(shuō)明LuxS蛋白和Pfs蛋白是合成AI-2的關(guān)建酶，具有重要的生物活性。pQE表達(dá)系統(tǒng)是一種可以高效表達(dá)和純化外源蛋白的系統(tǒng)。本研究同時(shí)考慮植物乳桿菌KLDS1.0391的luxS基因序列和載體上存在的酶切位點(diǎn)，最終選擇表達(dá)載體為pQE-30，且載體宿主細(xì)胞為E.coliM15。由于限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ的酶切緩沖液不一樣，而使用通用的緩沖液對(duì)重組質(zhì)粒p MD18-T simple-luxS進(jìn)行雙酶切，不能有效獲得目的片段，所以本研究采用分步酶切法獲得luxS基因，結(jié)果成功地獲得了重組蛋白。

4 結(jié)論

本研究利用克隆載體pMD 18-T simple與luxS基因連接，再利用兩種限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收獲得目的片段，并將其插入到表達(dá)載體p QE-30中，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到E.coliM15，經(jīng)Amp和Kana抗性平板篩選，再經(jīng)菌落PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了p QE-30-luxS原核表達(dá)體系，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。重組LuxS蛋白分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致，為17.4ku。

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