彩色馬鈴薯塊莖色素初步分析

李山云，隋啟君，楊瓊芬，盧麗麗，李文鵬，李先平，*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南昆明650205;2.云南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，云南昆明650205;3.云南大學(xué)省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650091)

色素是食品中至關(guān)重要的一種添加劑，從來源劃分可分為合成色素和天然色素兩大類［1］。合成色素由于其著色好、穩(wěn)定性高而得到廣泛使用，天然色素因安全性高且具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用而越來越多受到消費(fèi)者的歡迎［2-3］。很多研究表明，花色苷類天然色素具有很好的消除自由基，抗氧化，抑制血壓上升，減輕肝功能障礙，改善視覺，抑制糖尿病和抗癌等多方面作用，故對(duì)花色苷類天然色素的研究正成為食品研究的一大熱點(diǎn)［4-7］。對(duì)于花色苷類色素的研究，目前國(guó)內(nèi)主要集中在不同種類色素源的色素提取和穩(wěn)定性研究方面［8-9］，國(guó)外則開始向花色苷的分子結(jié)構(gòu)、在生物體內(nèi)的合成代謝、呈色機(jī)理及遺傳與調(diào)控等研究方向發(fā)展［10-12］。天然色素的來源主要是水果和蔬菜［13］，對(duì)于馬鈴薯，一直以來大家關(guān)注的主要是淀粉、薯片、薯?xiàng)l加工等領(lǐng)域，彩色馬鈴薯色素的研究還是馬鈴薯研究的新領(lǐng)域，特別是彩色馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效還未引起人們的關(guān)注，已有研究表明，彩色馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于普通馬鈴薯，而且其中含有的花青素具有抗腫瘤功效［14-15］。筆者所在的研究所自2000年就開始就把彩色馬鈴薯新品種選育作為一個(gè)重要的選育目標(biāo)，目前已選育出大批彩色馬鈴薯高代品系，本文所用的材料為四個(gè)四倍體彩色馬鈴薯新品系，且四個(gè)材料皮肉都帶有顏色，其中兩個(gè)為紫皮紫肉，兩個(gè)為紅皮紅肉，本文通過對(duì)四個(gè)彩色馬鈴薯品系塊莖的薯皮和薯肉中的色素提取純化、分離鑒定等研究，希望為食品工業(yè)的天然色素源的探索和彩色馬鈴薯的利用提供新的途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所雜交選育的馬鈴薯新品系，挑選新鮮、大小均勻、無病蟲害、個(gè)體完整無損傷、表皮無霉變的馬鈴薯。新品系的編號(hào)或名稱分別為:紫云1號(hào)，云薯603，S06-1693，S06-277。

UV2401PC紫外及可見分光光度計(jì) 日本島津;Oil bath B-485旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI;控溫多用高速組織攪碎機(jī) 江蘇江陰科研儀器廠;TGL-16G型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;G2410型掃描儀 惠普;SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽光科技儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯色素的提取 取新鮮馬鈴薯分別削取皮和肉各30g，用組織攪碎機(jī)加入100mL含0.1mol/L鹽酸的去離子水?dāng)囁?，將攪碎液轉(zhuǎn)入500mL容量瓶用丙酮定容，于4℃冰箱中放置24h，用布式漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃水浴加熱濃縮，10mL甲醇溶解色素粗提物，濾紙過濾兩次得到色素粗提液［4，8-9］。

1.2.2 馬鈴薯色素的紫外及可見光譜分析 取100μL色素初提液放入試管，加入2.9mL甲醇，用1.5mL離心管分裝后10000r/min下離心2min，取上清液放入分光光度計(jì)，200～600nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描。

用不銹鋼刀片小心取下層析板硅膠上的色帶，放入玻璃試管中，加入1mL的0.1%(體積比)鹽酸-甲醇溶液，經(jīng)振蕩器振蕩，于1.5mL離心管中10000r/min離心2min，取上清液加入1cm石英比色杯中，掃描波長(zhǎng)范圍為200～600nm，記錄掃描曲線和吸收峰，再加入3滴5%AlCl3甲醇溶液(質(zhì)量體積比)，混勻后，立即在同樣條件下掃描，觀察其最大吸收峰的變化，重復(fù) 3 次［16-17］。

1.2.3 馬鈴薯色素在不同pH下的吸光度和顏色分析 配制布列頓-羅賓遜緩沖液，在試管中加入100μL色素粗提液，加4.9mL p H緩沖液，拍照記錄，然后用分光光度計(jì)在各色素液的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定初始吸光度和放置24h后的吸光度。

1.2.4 馬鈴薯色素的薄層層析(TLC) 將層析板于110℃下活化1h，然后放置于干燥器中保存，用毛細(xì)管分別點(diǎn)樣，上樣量為10μL，等上樣點(diǎn)干后，在不同比例的BAW展層液中于4℃無光條件下層析，系統(tǒng)1(正丁醇∶冰乙酸∶水 =5∶2∶3);系統(tǒng) 2(正丁醇∶冰乙酸∶水 =6∶1∶2);系統(tǒng) 3(正丁醇∶冰乙酸∶水 =3∶3∶1);系統(tǒng) 4(正丁醇∶冰乙酸∶水 =6∶1.5∶2.5);系統(tǒng) 5(正丁醇∶冰乙酸∶水 =5∶4∶1);系統(tǒng) 6(正丁醇∶冰乙酸∶水 =4∶1∶2);系統(tǒng) 7(正丁醇∶冰乙酸∶水 =3∶1∶3)。層析完成后，測(cè)定Rf值=原點(diǎn)至層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離，并掃描［18-19］。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬鈴薯色素的紫外及可見光譜分析

四個(gè)馬鈴薯新品系的紫外及可見光譜掃描見圖1、圖2，分析表明，紫云1號(hào)的皮色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在276nm處有一個(gè)峰谷，在可見光區(qū)533nm處有一個(gè)吸收峰。紫云1號(hào)的肉色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在可見光區(qū)537nm處有一個(gè)吸收峰。S06-1693的皮色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在可見光區(qū)539nm處有一個(gè)吸收峰。S06-1693的肉色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在可見光區(qū)539nm處有一個(gè)吸收峰。S06-277的皮色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在324nm處有一個(gè)吸收峰，在可見光區(qū)511nm處有一個(gè)吸收峰。S06-277的肉色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在可見光區(qū)511nm處有一個(gè)吸收峰。云薯603的皮色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，在可見光區(qū)420、511nm處各有一個(gè)吸收峰。云薯603的肉色素粗提液在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，且在281.2和325.2nm處各有一個(gè)吸收峰，在可見光區(qū)512.8nm處有一個(gè)吸收峰。由紫外及可見光譜掃描圖可以看出，四個(gè)品種在可見光區(qū)500～550nm范圍內(nèi)都有吸收峰，這一范圍內(nèi)的吸收峰正是花色苷的特征吸收峰［20］，說明彩色馬鈴薯中含有的有色物質(zhì)主要是花青素類。紫皮紫肉的兩個(gè)品種紫云1號(hào)和S06-1693無論是皮還是肉在可見光區(qū)都只有一個(gè)吸收峰，且吸收峰的波長(zhǎng)幾乎一樣，說明兩個(gè)紫色品種含有相同的一種主要色素，因此粗提液的光吸收譜在可見光區(qū)只有一個(gè)峰。而紅皮紅肉的兩個(gè)品種S06-277和云薯603也同樣在511nm附近有吸收峰，說明兩個(gè)紅色品種中也含有同一種主要色素，但云薯603在420nm處也有一個(gè)吸收峰，說明其粗提液的光吸收譜受到了非花青素類物質(zhì)的干擾［21］。另外紫色品種與紅色品種的吸收峰不同，說明紫色品種含的主要色素與紅色品種含的主要色素種類不同。

圖1 薯皮中色素的紫外可見分光光譜Fig.1 UV-visible spectra of pigments from the tuber skin

圖2 薯肉中色素的紫外可見分光光譜Fig.2 UV-visible spectra of pigments from the tuber flesh

另外，對(duì)四個(gè)品種色素的粗提液進(jìn)行掃描后，分別滴加AlCl3甲醇溶液，各種色素提取液的吸收光譜都未出現(xiàn)紅移，說明色素粗提液中主要色素分子B環(huán)無鄰位酚羥基［13，18］。

表1 紫云1號(hào)不同PH下的色素溶液顏色Table 1 The color of the pigment solution of S.tuberosum cv.‘Ziyun no.1’at different pH value

表2 S06-1693不同pH下的色素溶液顏色Table 2 The color of the pigment solution of S.tuberosum cv.‘S06-1693’at different pH value

表3 S06-277不同PH下的色素溶液顏色Table 3 The color of the pigment solution of S.tuberosum cv.‘S06-277’at different pH value

2.2 不同pH色素溶液顏色和吸光度分析

2.2.1 紫云1號(hào)的色素溶液在不同pH下顏色和吸光度分析 從圖3可以看出，品種紫云1號(hào)的色素樣本在pH5.02以下放置24h吸光度比剛加入的色素樣本高，而pH在5.02～7之間時(shí)，該品種色素的吸光度值變化不明顯，特別是pH在5.02時(shí)，該品種色素?zé)o論皮色和肉色的吸光度值放置前后變化都不大，說明在此pH下該色素較為穩(wěn)定，當(dāng)pH在7以上時(shí)，放置后的色素樣本吸光度明顯降低。另外，在pH4.1時(shí)，放置24h的薯皮提取液吸光度明顯升高，分析原因可能是薯皮中含有的成分較為復(fù)雜，在此pH放置后，溶液中形成了具有強(qiáng)吸收性質(zhì)的物質(zhì)。而薯皮的趨勢(shì)線在放置前后差別較大，也說明薯皮中含有的影響光吸收的物質(zhì)比薯肉中多。從表1可以看出，紫云1號(hào)無論皮色和肉色色素提取液，在pH為2.09～4.1時(shí)，紅色由深變淺，在 pH為5.02～11.2時(shí)，紫色由淺變深。

圖3 紫云1號(hào)的吸光度變化Fig.3 The absorbency variation of S.tuberosum cv.’Ziyun no.1’

2.2.2 S06-1693的色素溶液在不同pH下顏色和吸光度分析 從圖4可以看出，S06-1693的色素樣本在pH6.09～11.2之間時(shí)，放置后的色素樣本吸光度明顯降低。在pH3.29～4.1時(shí)，該品種皮中色素吸光值度放置后比旋轉(zhuǎn)前升高而肉中色素吸光度值變化不大。從表2可以看出，S06-1693的皮色和肉色色素提取液在pH為2.09～4.1時(shí)，紅色由深變淺，在pH為5.02～11.2時(shí)，紫色由淺變深。

圖4 S06-1693的吸光度變化Fig.4 The absorbency variation of S.tuberosum cv.‘S06-1693’

2.2.3 S06-277的色素溶液在不同pH下顏色和吸光度分析 從圖5可以看出，品系S06-277的色素樣本在pH7以下放置24h吸光度比剛加入的色素樣本高，而pH在7.96～11.2之間時(shí)，放置后的色素樣本吸光度比放置前明顯降低。pH在7時(shí)，該品種色素?zé)o論皮色和肉色的吸光度值放置前后變化都不大，說明在此pH下該色素較為穩(wěn)定。從表3可以看出，S06-277的皮色色素提取液在pH為2.09～3.29時(shí)，紅色由深變淺，且pH3.29時(shí)顏色極淺近乎透明，在pH為4.1～11.2時(shí)，顏色由微紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)色。肉色色素提取液在pH為2.09～4.1時(shí)，紅色由深變淺，且pH3.29和4.1時(shí)顏色極淺近乎透明，在pH為5.02～11.2時(shí)，顏色由微紅色逐漸變?yōu)樽霞t。

圖5 S06-277的吸光度變化Fig.5 The absorbency variation of S.tuberosum cv.‘S06-277’

2.2.4 云薯603的色素溶液在不同pH下顏色和吸光度分析 從圖6可以看出，云薯603的色素樣本在pH7以下放置24h吸光度比剛加入的色素樣本高，而p H在7～11.2之間時(shí)，放置后的色素樣本吸光度明顯降低。p H在4.1時(shí)，該品種色素?zé)o論皮色和肉色的吸光度值放置前后變化都不大。從表4可以看出，云薯603皮色色素提取液在p H為2.09時(shí)為微紅色，在pH3.29～5.02時(shí)顏色極淺近乎透明，在p H為6.0～7.96時(shí)為微紅色。在p H8.9～11.2時(shí)為淺紫色，且紫色隨p H的升高而加深。肉色色素提取液在pH為2.09時(shí)為微紅色，在pH3.29～5.02時(shí)顏色極淺近乎透明，在pH為6.09～7時(shí)，為淺紅色。在pH7.96～11.2時(shí)為淺紫色，且紫色隨p H的升高而加深。

表4 云薯603不同pH下的色素溶液顏色Table 4 The color of the pigment solution of S.tuberosum cv.‘Yunshu603’at different pH value

圖6 云薯603的吸光度變化Fig.6 The absorbency variation of S.tuberosum cv.‘Yunshu603’

不論是紅色馬鈴薯還是紫色馬鈴薯，都表現(xiàn)出色素在酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下易降解的特點(diǎn)，有文獻(xiàn)指出，花色苷在不同的pH下會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，而且在堿性條件下會(huì)發(fā)生裂解，研究所用花色苷溶液在相同pH下吸光度的變化正反映了這種構(gòu)象的變化［21-22］。有些研究也指出，花色苷的色調(diào)會(huì)隨p H變化，pH從強(qiáng)酸性至中性再至堿性，花色苷的色調(diào)會(huì)從紅色變化至紫色乃至藍(lán)色，實(shí)驗(yàn)所提取的四種色素溶液也表現(xiàn)出了這一特點(diǎn)，這也進(jìn)一步說明了彩色馬鈴薯中的色素主要是花色苷類色素［23-24］。

另外，從不同p H色素溶液顏色變化來看，綜合分析，原皮色和肉色都為紫色的兩個(gè)品系紫云1號(hào)和S06-1693，無論其皮還是肉的色素提取液在不同pH下顏色變化的規(guī)律基本一致，都表現(xiàn)為酸性條件下顯紅色，中性和堿性條件下顯紫色，而原皮色和肉色都為紅色的兩個(gè)品系S06-277和云薯603，無論其皮還是肉的色素提取液在不同pH下顏色變化的規(guī)律也基本一致，都表現(xiàn)出隨pH的升高，顏色從紅色變?yōu)闊o色再變?yōu)榧t色最后為紫色的趨勢(shì)，說明這兩個(gè)紫色品種含有同一種主要色素，而兩個(gè)紅色品系也含有同一種主要色素，且紫色品種中的主要色素與紅色品種中的主要色素種類不同。

2.3 色素的薄層層析分析

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)后，選擇了7個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行四個(gè)品種色素的薄層層析，7個(gè)系統(tǒng)所呈現(xiàn)的條帶數(shù)見表5，從表5可知，系統(tǒng)7對(duì)四個(gè)品系的分離效果都較好，系統(tǒng)7所呈現(xiàn)的顏色見表6。

從表5可以看出，不同的層析系統(tǒng)對(duì)不同的材料分離效果差別很大，比較而言，系統(tǒng)3的分離效果最差，系統(tǒng)7的分離效果最好。從系統(tǒng)7的層析圖可看出，全紫皮全紫肉的品種紫云1號(hào)層析分離的條帶最多，皮中清晰可見7條條帶，肉中清晰可見6條條帶，全紫皮部分紫肉的品種S06-1693皮中清晰可見5條條帶，肉中清晰可見4條條帶。全紅皮全紅肉的品種S06-277皮中清晰可見5條條帶，肉中清晰可見3條條帶。全紅皮部分紅肉的品種云薯603皮中清晰可見4條條帶，肉中清晰可見3條條帶。從系統(tǒng)的配比分析，水的比例較高的系統(tǒng)由于擴(kuò)散速度慢，因而得到的條帶也較多。

表5 不同層析系統(tǒng)得到的條帶數(shù)Table 5 The strips in different thin layer chromatography systems

許多研究表明，馬鈴薯塊莖的顏色主要由類胡蘿卜素(carotenoids)和花色(素)苷(anthocyanins)兩類化合物決定，類胡蘿卜素決定馬鈴薯塊莖“皮”，“肉”的白色、黃色，而花色苷會(huì)使得馬鈴薯塊莖“皮”，“肉”呈現(xiàn)紅色、紫色、藍(lán)色等諸多色彩。在馬鈴薯中已發(fā)現(xiàn)了植物中常見的六種花色素(anthocyanidins):矮牽牛色素(petunidin)、天竺葵色素(pelargonidin)、錦葵色素(malvidin)、芍藥色素(peonidin)、矢車菊素(cyanidin)和飛燕草色素(delphinidin)，但不同馬鈴薯品種中含有的花色素種類和含量差異較大［25］。Lewis等［26］用 HPLC 的方法對(duì)26個(gè)彩色馬鈴薯品種所含色素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紅色馬鈴薯富含天竺葵色素和少量芍藥花色素，紫色馬鈴薯則富含矮牽?；ㄉ睾湾\葵色素。趙昶靈等［27］用紫外及可見光譜分析云南‘轉(zhuǎn)心烏’馬鈴薯塊莖色素，結(jié)果表明‘轉(zhuǎn)心烏’中的紫色素屬于黃酮類化合物，可能含有酚性鄰位二羥基。盧其能等［28］用薄層層析和紫外及可見光譜分析法對(duì)一個(gè)紅皮和一個(gè)紫皮的兩個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行研究，初步判斷馬鈴薯紅色色素主要為天竺葵素衍生物，而紫色色素主要為錦葵素衍生物。

綜合表6和圖7分析，這四個(gè)品種中都含有類胡蘿卜素和花青素，在所有品種的層析圖中都有一條橙黃色帶，其Rf值都在0.9附近，由文獻(xiàn)可推知此色帶為β-胡蘿卜素呈現(xiàn)的條帶［29］。紫色品種中，紫云1號(hào)皮中顯紫色的條帶Rf平均值為0.60，肉中顯紫色的條帶Rf平均值為0.63;S06-1693皮中顯紫色的條帶Rf平均值為0.59，肉中顯紫色的條帶Rf平均值為0.59。紅色品種中，云薯603皮中顯紅色的條帶Rf平均值為0.75，肉中顯紅色的條帶Rf平均值為0.62;S06-277皮中顯紅色的條帶Rf平均值為0.79，肉中顯紅色的條帶Rf平均值為0.67。從Rf值可以看出，紫色品種中的主要色素分子量較大，因而遷移速度慢，而紅色品種的主要色素分子量較小，遷移速度快。

表6 層析系統(tǒng)7曾現(xiàn)的條帶顏色Table 6 The color of the strips in No.7 of thin layer chromatography systems

圖7 層析系統(tǒng)7呈現(xiàn)的條帶示意圖Fig.7 Diagrammatic drawing of the strips in no.7 of thin layer chromatography systems

3 結(jié)論

3.1 從色素提取液不同p H吸光度的分析來看，馬鈴薯色素在酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下易降解，與其他文獻(xiàn)報(bào)道基本相同，因此在提取馬鈴薯中的色素時(shí)應(yīng)在酸性條件下提取。

3.2 實(shí)驗(yàn)中得到的馬鈴薯色素從紫外-可見光譜分析和不同pH下顏色變化規(guī)律都說明兩個(gè)紫色品種含有同一種主要色素，而兩個(gè)紅色品系也含有同一種主要色素，且紫色品種中的主要色素與紅色品種中的主要色素種類不同。另外，紫色馬鈴薯的色素含量比紅色馬鈴薯要高，因此在工業(yè)開發(fā)上紫色馬鈴薯更具色素開發(fā)價(jià)值。

3.3 利用BAW展層液可對(duì)馬鈴薯色素液進(jìn)行分離純化，在本實(shí)驗(yàn)條件下，分離效果最好的層析系統(tǒng)為正丁醇∶冰乙酸∶水 =3∶1∶3。

3.4 根據(jù)計(jì)算所得Rf值，兩個(gè)紫皮紫肉品種顯紫色的條帶的Rf值小于0.7，色素粗提液紫外可見光譜的特征吸收峰在533～539nm之間，滴加AlCl3甲醇溶液，色素粗提液的吸收光譜都未出現(xiàn)紅移，結(jié)合文獻(xiàn)可推斷紫肉品系中的色素主要為錦葵色素衍生物。而兩個(gè)紅皮紅肉品種最大色素組分層析條帶的Rf值在0.7～0.8之間，滴加AlCl3甲醇溶液，色素粗提液的吸收光譜都未出現(xiàn)紅移，色素粗提液紫外可見光譜的特征吸收峰在511～513nm之間，結(jié)合文獻(xiàn)推斷紅肉品系中的色素主要為天竺葵色素衍生物［28，30-31］。

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