葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

閔子揚(yáng) ，童龍 ，李玲 ，王志偉 ，唐炎英 ，肖璐 ，李涵 ，孫小武 ,3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙，410128；2.湖南省農(nóng)科院；3.湖南省瓜類研究所）

葫蘆科（Cucurbitaceae）植物包括118個(gè)屬共825個(gè)種，廣泛分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)。中國分布約有29個(gè)屬，142個(gè)種，其中大部分是人們喜愛的瓜類蔬菜作物如西瓜（Citrullus lanatus）、黃瓜（Cucumis sativus.L.）、 苦瓜 （Momordica charantia L.）、 南 瓜（Cucurbita pepo L.）等。葫蘆科是世界上最重要的食用植物科之一，僅次于禾本科、豆科和茄科，在人們生活中具有重要的作用[1]。

葫蘆科植物在常規(guī)育種過程中存在育種年限長、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定等情況，嚴(yán)重制約了葫蘆科植物在生產(chǎn)上的進(jìn)一步利用。近年來，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，為這一問題的解決帶來了曙光。游離小孢子技術(shù)研究于20世紀(jì)70年代初開始，1982年在蕓薹屬作物上首次獲得成功[2]。小孢子是直接從花藥或花蕾中游離出來的天然分散的細(xì)胞，具有單倍體和單細(xì)胞的特性。游離小孢子培養(yǎng)是指直接培養(yǎng)植物小孢子，誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生和植株再生，經(jīng)染色體加倍后直接獲得遺傳上純合的雙單倍體株系（DH），從而大大簡(jiǎn)化常規(guī)育種中自交純合程序，縮短育種年限，加速蔬菜新品種選育。近年來，游離小孢子培養(yǎng)已經(jīng)在大白菜、胡蘿卜、青花菜、辣椒、茄子、小麥、大麥等作物上獲得了再生的單倍體植株，但是在葫蘆科植物上的研究還相對(duì)較少，僅在黃瓜[3]和西瓜[4]上獲得了胚狀體或再生植株。為了總結(jié)前人在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)上的研究成果，為以后的相關(guān)研究提供指導(dǎo)，對(duì)葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的影響因素進(jìn)行了綜述。

1 供體植株對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

供體植株對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響主要體現(xiàn)在植株的基因型、植株生長狀況和生長環(huán)境、小孢子發(fā)育時(shí)期等方面。

1.1 基因型

基因型對(duì)小孢子培養(yǎng)中胚狀體的發(fā)生具有決定性作用，不同基因型材料在相同的培養(yǎng)條件下成胚率有很大差異。詹艷等[3]對(duì)10份黃瓜的供試材料進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，只有4份試材獲得了胚狀體，其中成胚率最高的是“7447”，為每皿31.2個(gè)，最低的是“康德”，為每皿1.5個(gè)。剩余的6份材料中有些游離小孢子出現(xiàn)膨大，有些已啟動(dòng)分裂，但均未能繼續(xù)分裂形成胚狀體。李娟等[4]在西瓜上的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生種和栽培種的成胚率有顯著差別，前者要高于后者。緱艷霞[5]和董艷榮[6]分別在西瓜和甜瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中得出F1代植株的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯大于親本，表現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)，說明小孢子的基因型至少是決定培養(yǎng)能力的因素。

1.2 植株的生長狀況和環(huán)境

供體植株的生長狀況和生長環(huán)境對(duì)小孢子的胚胎發(fā)生也有重要影響。有研究表明，如果在小孢子的形成過程中遇到連續(xù)的陰雨天氣或者是嚴(yán)重的光照不足，小孢子的活力就會(huì)嚴(yán)重降低以至于影響小孢子的成胚率。張鳳蘭等[7]利用人工氣候室研究了光照和溫度對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響，結(jié)果表明，光照時(shí)數(shù)為14 h、溫度為20℃時(shí)最利于小孢子胚胎的發(fā)生，產(chǎn)胚量最高。曹鳴慶等[8]報(bào)道生長在日照14～16 h、溫度15～20℃條件下的植株在小孢子培養(yǎng)的過程中成胚率最高。供體植株的栽培季節(jié)對(duì)獲得較高活力的小孢子也非常重要，謝淼等[9]利用取自不同季節(jié)的黃瓜花藥進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于季節(jié)的不同，所接種黃瓜花藥的誘導(dǎo)率不同，秋季的誘導(dǎo)率低于春季。另外，供體植株的營養(yǎng)狀況也是影響小孢子胚胎發(fā)生的重要因素，供體植株栽培密度過大則小孢子的成胚率降低[10]。

1.3 小孢子的發(fā)育時(shí)期

小孢子的發(fā)育時(shí)期是影響小孢子培養(yǎng)效果的重要因素[11]?；ǚ坌℃咦影l(fā)育可分為四分體時(shí)期、單核期、雙核期和三核期，單核期又可細(xì)分為單核早期、單核中期和單核晚期。因細(xì)胞具有全能性，理論上所有時(shí)期的小孢子都能發(fā)育成為一個(gè)完整的植株，但是實(shí)際上只有那些處于特定時(shí)期的小孢子才能在離體條件下從配子體發(fā)育途徑經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育途徑，最終形成胚狀體。詹艷[12]探究了3份黃瓜材料不同小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)小孢子成胚率的影響，結(jié)果表明，只有單核靠邊期的小孢子才能誘導(dǎo)成胚。董艷榮[6]關(guān)于甜瓜的研究表明，花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期到雙核期，李娟[4]在西瓜中也有類似報(bào)道。目前的研究結(jié)果表明，小孢子處于單核靠邊期時(shí)誘導(dǎo)成胚率都是最高的。

小孢子的發(fā)育階段跟花蕾的外部形態(tài)有密切關(guān)系，通過對(duì)花蕾外部形態(tài)如長度、顏色的觀察可以大致確定小孢子所處的發(fā)育階段。葫蘆科不同植物小孢子培養(yǎng)的最適花蕾長度見表1，但是Turlingn[13]在進(jìn)行油菜花藥培養(yǎng)時(shí)曾指出，雖然花蕾大小是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標(biāo)，但它也隨著供體植株的基因型、生長條件、發(fā)育階段和花序等的變化而變化，所以花蕾長度只能作小孢子發(fā)育時(shí)期的參考指標(biāo)，具體發(fā)育時(shí)期還要進(jìn)一步鑒定。

表1 一些葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的最適花蕾長度

2 培養(yǎng)基及其成分對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

培養(yǎng)基的種類和成分對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響顯著，主要因素為基本培養(yǎng)基的種類、碳源物質(zhì)種類、培養(yǎng)基中添加的激素種類和濃度以及是否添加活性炭。

2.1 基本培養(yǎng)基的種類

在大多數(shù)葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)中所用的基本培養(yǎng)基都是MS，但是也有一些其他的報(bào)道。蘇華等[17]研究了B5，MS，Nitsch，N6四種基本培養(yǎng)基對(duì)黃瓜花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基中MS對(duì)津春3號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著低于其他培養(yǎng)基。詹艷等[3]指出在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中，NLN和B5作為基本培養(yǎng)基時(shí)獲得的胚狀體產(chǎn)量差異不顯著，但NLN更有利于球形胚進(jìn)一步發(fā)育形成子葉形胚。董艷榮[6]將MS培養(yǎng)基中的Fe-EDTA、Mg2SO4·7H2O和VB1增加一倍得到改良的MS培養(yǎng)基MSKI，用作甜瓜的小孢子培養(yǎng)取得了良好的效果。

2.2 碳源

葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中使用的碳源和滲透調(diào)節(jié)劑以蔗糖為主，其類型和濃度對(duì)小孢子存活以及胚狀體的形成具有很大的影響，不同作物的最適蔗糖濃度有所差別，但以13%最為有利[3，18]。在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)時(shí)也有一些使用麥芽糖的報(bào)道，但是關(guān)于這兩種碳源到底哪一種更有利于小孢子的培養(yǎng)目前還未見報(bào)道，僅陳振光[19]、何艷等[20]在苦瓜的花藥培養(yǎng)中得出蔗糖作為碳源比麥芽糖更有利的結(jié)論。在十字花科蔬菜的小孢子培養(yǎng)中有在培養(yǎng)初期使用較高濃度蔗糖（17%）以保持小孢子的活力，一定時(shí)間（1～4 d）后加液稀釋或更換培養(yǎng)基降低蔗糖濃度到10%～14%來促進(jìn)小孢子分裂可以顯著提高胚產(chǎn)量的報(bào)道[21]，但這種方法在葫蘆科蔬菜上還未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

2.3 激素

在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)過程中，激素的種類和配比對(duì)胚狀體的形成起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)常使用的激素有生長素和細(xì)胞分裂素兩大類，前者包括 2，4-D、IAA、NAA 等， 后者包括 6-BA、ZT、KT等。不同植物激素在培養(yǎng)中的作用不同，生長素可以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和根的分化，而細(xì)胞分裂素則能促使細(xì)胞分裂和胚狀體的形成。蘇華等[17]在關(guān)于黃瓜花藥培養(yǎng)的研究中指出，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大的是2，4-D。緱艷霞[5]在西瓜花藥培養(yǎng)中同樣發(fā)現(xiàn)，2，4-D在西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，但其質(zhì)量濃度不宜超過0.5 mg/L。但也有學(xué)者指出在瓜類花藥愈傷組織的形成過程中，6-BA是一個(gè)關(guān)鍵因素。大量瓜類花藥培養(yǎng)試驗(yàn)表明，在基本培養(yǎng)基中添加6-BA能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，配合2，4-D 和 KT使用效果更好[22]。詹艷[12]在關(guān)于黃瓜小孢子培養(yǎng)的試驗(yàn)中把2，4-D和6-BA配合使用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長春密刺、7447和康德三個(gè)黃瓜品種在2，4-D 0.5 mg/mL+6-BA 0.2 mg/mL的培養(yǎng)基上都誘導(dǎo)了胚胎的發(fā)生，長春密刺在無外源激素的培養(yǎng)基和濃度較高（2，4-D 1 mg/mL+6-BA 0.5 mg/mL 和 2，4-D 2 mg/mL+6-BA 1 mg/mL）的培養(yǎng)基上雖有胚狀體產(chǎn)生但產(chǎn)量顯著降低。此試驗(yàn)說明外源激素是小孢子胚胎發(fā)生的必要條件，但是所需濃度較低。

2.4 活性炭

關(guān)于活性炭在小孢子培養(yǎng)中的作用，Weatherhead和Hensaw指出活性炭能吸附培養(yǎng)基中對(duì)小孢子生長發(fā)育有一定抑制作用的5-羥甲基糠醛、酚類物質(zhì)以及雜質(zhì)等，從而提高出胚率[23]。在十字花科、茄科以及禾本科的小孢子培養(yǎng)中使用活性炭提高小孢子出胚率的報(bào)道已經(jīng)很多，但是也有人指出活性炭在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附有益物質(zhì)如NAA、6-BA等，所以不同試驗(yàn)材料效果可能有顯著差異。緱艷霞[5]和喻財(cái)鈴[24]分別在西瓜和絲瓜的花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)加入活性炭出胚效果差，有抑制愈傷組織形成的作用。

3 培養(yǎng)技術(shù)對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

小孢子的培養(yǎng)技術(shù)主要包括花蕾的低溫預(yù)處理和游離小孢子的高溫預(yù)培養(yǎng)，其目的主要是從形態(tài)上改變其極性分布，從生理代謝上改變其生理狀態(tài)，從而改變小孢子的發(fā)育途徑使其由配子體發(fā)育途徑向孢子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變，對(duì)培養(yǎng)中能否出現(xiàn)胚狀體至關(guān)重要。

3.1 花蕾的預(yù)處理

在游離小孢子培養(yǎng)中預(yù)處理的方法很多，如低溫、高溫、熱激、離心以及甘露醇處理等，在葫蘆科中一般使用的預(yù)處理方法是低溫預(yù)處理，處理溫度為4℃。針對(duì)不同的作物處理的時(shí)間有所差別，魏瑛[25]指出，西瓜花藥在4℃處理72 h效果最佳；Ashok Kumar[26]等將黃瓜花蕾在4℃和32℃下分別處理1～10 d。結(jié)果表明，在4℃條件下處理2 d的效果最佳；董艷榮[6]的研究結(jié)果表明，甜瓜花藥在4℃條件下處理36 h效果最好；Metwally等[27]指出，南瓜在4℃的最佳預(yù)處理時(shí)間是4 d。但是也有報(bào)道指出，苦瓜愈傷組織的誘導(dǎo)率隨著在4℃預(yù)處理時(shí)間的延長而降低，預(yù)處理天數(shù)達(dá)到4 d時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率大幅降低[28]。

3.2 游離小孢子的預(yù)培養(yǎng)

游離小孢子在進(jìn)行正常溫度（25～28℃）培養(yǎng)之前首先對(duì)其進(jìn)行一段時(shí)間的高溫預(yù)培養(yǎng)是很有必要的，這在十字花科小孢子培養(yǎng)中已經(jīng)得到證實(shí)。高溫預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間一般為24～48 h，處理溫度因植物種類不同而稍有差異（30～36℃）。有報(bào)道指出，與處于25℃恒溫條件下培養(yǎng)的小孢子相比，經(jīng)高溫預(yù)培養(yǎng)的小孢子在培養(yǎng)前3 d活力會(huì)有所降低，但是從第4天開始小孢子的活力顯著高于對(duì)照[29]。雖然高溫預(yù)處理在十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，并且取得了很好的效果，但在葫蘆科蔬菜作物僅有緱艷霞[5]在西瓜的花藥培養(yǎng)中把花藥先在30℃條件下培養(yǎng)72 h然后轉(zhuǎn)到25℃條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高。

3.3 接種密度對(duì)成胚率的影響

接種密度與成胚率表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，接種密度過大，小孢子在培養(yǎng)基中競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分和空間，不利于小孢子的生長；密度過小促進(jìn)物質(zhì)無法形成，也不利于愈傷組織的形成。Duijs等[30]關(guān)于小孢子密度對(duì)培養(yǎng)效果的研究表明，當(dāng)小孢子密度在2×104～4×104個(gè)/mL時(shí)最有利于胚狀體的形成。緱艷霞[5]在西瓜花藥培養(yǎng)中指出，通常在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中接種4個(gè)花蕾的20枚花藥最為合適。

4 存在問題與進(jìn)一步研究方向

雖然小孢子培養(yǎng)在育種及生物技術(shù)的運(yùn)用等方面用處很大，但是關(guān)于小孢子培養(yǎng)技術(shù)的一些機(jī)制目前還不是很清楚，只是在十字花科、茄科及禾本科上得到了實(shí)際應(yīng)用，在葫蘆科蔬菜上目前還停留在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)階段。存在的主要問題是小孢子無法啟動(dòng)萌發(fā)或者是成胚率太低、不同物種或不同基因型間差異較大、形成的愈傷組織或者是胚狀體無法進(jìn)一步發(fā)育成為單倍體植株。在以后的研究中我們要從碳源、生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度、活性炭的應(yīng)用、預(yù)培養(yǎng)的溫度以及時(shí)間幾個(gè)方面入手，爭(zhēng)取早日建立成熟的葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的植株再生體系，從而使小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種以及其他生物技術(shù)的應(yīng)用中發(fā)揮積極的作用。

[1]王秀峰.蔬菜栽培學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：235-236.

[2]余鳳群.蕓薹屬植物未成熟小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究和應(yīng)用[J].中國油料，1994，16（2）：70-73.

[3]詹艷，陳勁楓.黃瓜游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)成胚和植株再生[J].園藝學(xué)報(bào)，2009，36 （2）：221-226.

[4]李娟.西瓜花藥和小孢子培養(yǎng)研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[5]緱艷霞.西瓜花藥離體培養(yǎng)技術(shù)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2006.

[6]董艷榮.甜瓜花藥再生體系的基礎(chǔ)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[7]張鳳蘭，釘貫靖久，吉川宏昭.環(huán)境條件對(duì)白菜小孢子培養(yǎng)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9（1）：95-100.

[8]曹鳴慶，李巖，劉凡.基因型和供體植株生長環(huán)境對(duì)大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1993，8（4）：1-6.

[9]謝淼，秦麗穎，潘俊松，等.黃瓜花器形態(tài)發(fā)生、小孢子發(fā)育與花藥培養(yǎng)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005，2（56）：1 096-1 100.

[10]Chuong P V,Deslaurisers C,Kott L S,et al.Effects of dondr genotype and bud sampling onmicrospore culture of Brassica napus[J].Can J Bot,1988,66:1 653－1 657,1 676－1 680.

[11]王玉英，孫敬三，王敬駒，等.小黑麥和辣椒花粉植株的誘導(dǎo)[J].中國科學(xué) A 輯，1973（1）：41-45.

[12]詹艷.黃瓜花藥培養(yǎng)與游離小孢子培養(yǎng)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[13]Turlingn C.The in fluence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspore in cultured anthers of Brassica napus ssp.oleifera [J].Ann Bot,London,1984,54:689-693.

[14]馬德偉，徐雙才，王靈敏.甜瓜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及花粉粒發(fā)育的研究[J].中國西瓜甜瓜，1988（1）：20-23.

[15]崔群香，劉衛(wèi)東，王倩，等.南瓜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及雄 配 子 體 發(fā) 育 研 究 [J].安 徽 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ，2012，40（7）：3 941－3 944.

[16]王朝陽.西葫蘆胚珠培養(yǎng)技術(shù)及雄花花粉發(fā)育研究[D].西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[17]蘇華，金定燕，任華中.黃瓜花藥培養(yǎng)中若干影響因素的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（3）：470-472.

[18]羊杏平，陳學(xué)好，周峰.不同預(yù)處理對(duì)西瓜小孢子存活率的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：1 104-1 108.

[19]陳振光.園藝植物離體培養(yǎng)學(xué) [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：23-25.

[20]何艷，李煥秀，鄭陽霞，等.苦瓜花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的研究[J].北方園藝，2008（12）：164-166.

[21]任飛，王羽梅.我國十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)，2010，31（3）：77-83.

[22]耿晨光，何剛.瓜類花藥培養(yǎng)中激素和碳源的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].長江蔬菜，2008（14）：5-9.

[23]江偉，王小霞，鮮開梅，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究[J].北方園藝，2007（5）：49－51.

[24]喻財(cái)鈴.絲瓜小孢子囊與雄配子體發(fā)育的研究和花藥離體培養(yǎng)初探[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

[25]魏英.低溫預(yù)處理對(duì)西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，1999（9）：34-36.

[26]袁萬良，付潤民，雷保林，等.西瓜花培試驗(yàn)初報(bào)[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995（1）：29-30.

[27]Metwally E L,Moustafa S A,Shalaby T A.Haplod plantlets derived by anther culture of Cucurbita pepo[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1998,52(3):171-176.

[28]何艷.苦瓜花藥離體培養(yǎng)初探[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[29]栗根義，高睦槍，楊建平.利用游離小抱了培養(yǎng)技術(shù)育成豫白菜 7 號(hào)（豫園 1 號(hào)）[J].中國蔬菜，1998（4）：16-19.

[30]Duijs JG,Voorrips R E,Visser D L,et al.Microspore culture is successful in most types of Brassic aoleracea L.[J].Euphytica,1992,60:45-55.