miR-106b～25基因簇增強(qiáng)乳腺癌MCF-7腫瘤干細(xì)胞相關(guān)耐藥性

胡蘊(yùn)慧，盛夢(mèng)瑤，張孝云，李雙靜，范冬梅，熊冬生，周 圓

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020;2.天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺三科，天津 300060)

乳腺癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤之一，化療在乳腺癌的綜合治療中占有重要地位，但其耐藥性的形成仍是導(dǎo)致患者臨床化療失敗及預(yù)后不良的主要原因。2003年Al-Hajj等［1］首次證實(shí)了乳腺癌干細(xì)胞的存在，按照腫瘤干細(xì)胞學(xué)說，腫瘤干細(xì)胞是化療后腫瘤復(fù)發(fā)的根本原因［2］，但乳腺癌耐藥性的形成與腫瘤干細(xì)胞之間的相互關(guān)系尚未完全明確。

微小RNA(miRNA)是一類高度保守的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用日益顯現(xiàn)［3］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，miRNA的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致多種重要基因表達(dá)紊亂，這與腫瘤干細(xì)胞及細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)［4］。定位于人基因組7號(hào)染色體的miR-106b～25基因簇包含miR-106b、miR-93和miR-25 3個(gè) miRNA，該基因簇經(jīng)常作為致癌因素，通過抑制抑癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［5］。本研究通過慢病毒感染，提高乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)miR-106b～25表達(dá)水平。通過觀察其對(duì)細(xì)胞耐藥性及干細(xì)胞特性的影響，進(jìn)一步明確該miRNA基因簇與腫瘤耐藥發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7與人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293T由英國(guó)帝國(guó)理工大學(xué)Ernesto Yague博士惠贈(zèng)，細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 FUW-miR-106b～25真核表達(dá)載體的構(gòu)建與慢病毒感染 從MCF-7細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增出miR-106b～25基因簇，上游引物5'-GGGGATCCATAGCCATGTGCCGCGAGAAGCAGCCCATG-3'，下 游引物5'-GGGAATTCCTAGCTGTCTGCCCCTTGTCTCC TAGAAGAGAG-3'，PCR產(chǎn)物連接至載體 pCR2.1-TOPO上，測(cè)序鑒定基因堿基序列無誤后用BamHI與EcoRI做雙酶切，酶切產(chǎn)物連接至慢病毒載體FUW中，構(gòu)建成FUW-miR-106b～25(FUW-mirC)真核表達(dá)載體。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待匯合度達(dá)到95%時(shí)，按照Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒包括20μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，8 μg PAX2 與 2 μg Vsvg 慢病毒包裝質(zhì)粒，8 h后終止轉(zhuǎn)染，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集病毒上清并用0.45微米濾膜過濾，加入終濃度為8 mg·L－1聚凝胺后感染MCF-7細(xì)胞，8 h后終止病毒感染換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按5×104細(xì)胞/孔接種于12孔板，從次日起每日取3個(gè)孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，連續(xù)進(jìn)行6 d后繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 基因表達(dá)檢測(cè) 按照Exiqon-miRCURY RNA提取試劑盒的說明書提取細(xì)胞中包括總RNA，取2 μg RNA使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)成cDNA，SYBR Green法檢測(cè) MDR1與 ALDH1的的表達(dá)，按照Takara公司SYBR Premix Ex Taq說明書進(jìn)行操作。PCR引物序列見 Tab 1。miR-25、miR-93與 miR-106b的表達(dá)應(yīng)用Taqman實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)，操作方法與數(shù)據(jù)分析按照ABI-TaqMan microRNA assay說明書進(jìn)行。

Tab 1 primer sequence for RT-QPCR assay

1.4 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法［6］，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×104細(xì)胞/孔接種于96孔板，24 h后加入不同濃度阿霉素，培養(yǎng)72 h加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，室溫震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定592 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(OD值)，取3個(gè)重復(fù)孔的平均OD值，計(jì)算阿霉素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 耐藥克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按3×105細(xì)胞/25 cm2接種于培養(yǎng)瓶，貼壁過夜。用不同濃度阿霉素處理各組細(xì)胞5 d后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，14 d后用4%多聚甲醛液室溫固定30 min，然后0.2%結(jié)晶紫溶液室溫染色30 min，去離子水漂洗數(shù)次后風(fēng)干、拍照。

1.6 細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按3×105細(xì)胞/25 cm2接種于培養(yǎng)瓶，貼壁過夜。用不同濃度阿霉素處理各組細(xì)胞5 d后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，14 d后按照 Cell Signaling Technology公司senescence β-galactosidase試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察，藍(lán)色細(xì)胞為衰老細(xì)胞。

1.7 細(xì)胞P-gp的表達(dá)檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗1遍，加PE標(biāo)記的P-gp直標(biāo)抗體4℃避光孵育1 h，PBS洗2遍后用400 μl PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 ALDH1的表達(dá)檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗1遍，按照StemCell Technology-ALDH檢測(cè)試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 Mammosphere形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞重懸于含有 B27、20 μg·L－1EGF 與 20 μg·L－1bFGF的無血清乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，按2×103細(xì)胞/孔接種于超低粘附培養(yǎng)板中，14 d后倒置顯微鏡下對(duì)形成的mammosphere計(jì)數(shù)拍照。收集培養(yǎng)板中的mammosphere，用胰酶消化并反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并重新接種于超低粘附培養(yǎng)板中，10 d后對(duì)二次形成的mammosphere計(jì)數(shù)、拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-106b～25基因簇過表達(dá)細(xì)胞系MCF-7-mirC的建立 體外構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體FUW-mirC，聯(lián)合慢病毒包裝質(zhì)粒PAX2與Vsvg共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，收集病毒上清液感染MCF-7細(xì)胞。提取各組總RNA，檢測(cè)miR-25、miR-93與miR-106b表達(dá)水平。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組3種miRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組(Fig 1A)，而且體外培養(yǎng)觀察MCF-7-FUW與MCF-7-mirC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并無明顯差異(Fig 1B)。

Fig 1Establishment of MCF-7-mirC cell line(±s，n=3)

2.2 miR-106b～25基因簇對(duì)阿霉素敏感性的影響

MTT法比較MCF-7-FUW與MCF-7-mirC細(xì)胞對(duì)阿霉素72 h IC50的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-106b～25對(duì)細(xì)胞短期內(nèi)的耐藥性沒有明顯影響(Fig 2A)。但耐藥克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-106b～25基因簇能幫助細(xì)胞更快脫離阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞衰老樣狀態(tài)(Fig 2B)，重新進(jìn)入正常的細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致更多耐藥克隆的形成(Fig 2C)。

2.3 miR-106b～25基因簇不改變P-gp的表達(dá)miR-106b～25基因簇能賦予MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，但實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明在過表達(dá)miR-106b～25基因簇之后，P-gp蛋白的編碼基因MDR1在mRNA水平上并未升高(Fig 3A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果同樣顯示各組細(xì)胞在P-gp熒光強(qiáng)度上也沒有明顯差別(Fig 3B)，證明miR-106b～25基因簇并未通過促進(jìn)P-gp表達(dá)增加細(xì)胞耐藥性。

2.4 miR-106b～25基因簇對(duì)乳腺癌細(xì)胞干性的影響 越來越多的研究證明腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)的根本原因。ALDH1作為腫瘤干細(xì)胞陽性標(biāo)記物，實(shí)時(shí)定量PCR與ALDH1活性檢測(cè)結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比，MCF-7-mirC組細(xì)胞中ALDH1在mRNA水平上表達(dá)升高，ALDH1high細(xì)胞群比例增多(Fig 4A，B)。Mammosphere形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MCF-7-mirC細(xì)胞形成的mammosphere體積更大而且比例更高(Fig 4C，D)。二次mammosphere形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示了兩組細(xì)胞間的差距，提示miR-106b～25基因簇能增強(qiáng)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞特性。

3 討論

miRNA是近年來在真核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，主要通過與靶mRNA的3’UTR結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA降解及抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯［7］。miRNAs涉及多個(gè)基因及信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，不僅影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，還對(duì)乳腺癌耐藥的形成發(fā)揮重要影響［8］。已有研究證明多個(gè)miRNA參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，例如miR-451與miR-326已被證實(shí)可直接靶向MDR1基因，參與乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素以及依托泊苷耐藥性的獲得［9－10］。miR-328通過調(diào)控ABC家族BCRP蛋白表達(dá)，在米托蒽醌耐藥的乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用［11］。另外，miR-21、miR-221/222、miR-17-5p、miR-34 等 miRNA 可通過調(diào)控腫瘤抑制因子、DNA損傷、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期相關(guān)通路間接對(duì)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性發(fā)揮作用。

乳腺癌干細(xì)胞是指乳腺癌細(xì)胞中少數(shù)成瘤能力極強(qiáng)、具有自我更新能力和一定分化潛能的細(xì)胞。乳腺癌干細(xì)胞高表達(dá)ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和抗凋亡基因等而逃避化療藥物對(duì)它們的作用，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)［2］。乳腺癌干細(xì)胞耐藥機(jī)制目前還未完全研究清楚，近年來發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞中miRNA表達(dá)異常與乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。

Fig 2 Effects of miR-106b-25 overexpression on chemoresistance of MCF-7 cells

Fig 3Expression of P-gp/MDR1 in MCF-7-mirC(±s，n=3)

miR-106b～25基因簇廣泛表達(dá)于人肺、淋巴、脾臟、睪丸、腸等組織，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miR-106b～25基因簇過表達(dá)于多種腫瘤組織。臨床數(shù)據(jù)顯示，該基因簇能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并可能與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)［12］。研究結(jié)果表明，miR-106b～25基因 簇 可 通 過 調(diào) 控 Bim［13］、p21［14］、PTEN［15］、Smad7［16］表達(dá)，作用于細(xì)胞凋亡通路、改變細(xì)胞遷移侵襲能力、影響細(xì)胞周期及腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境［15］，但是該基因簇對(duì)于腫瘤耐藥形成的作用機(jī)制尚未闡明。本研究通過慢病毒感染技術(shù)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá) miR-106b～25基因簇，獲得MCF-7-mirC細(xì)胞。用相同劑量阿霉素處理MCFFUW與MCF-7-mirC細(xì)胞后，MCF-7-mirC細(xì)胞能更快的脫離細(xì)胞衰老樣狀態(tài)，重新恢復(fù)正常的細(xì)胞增殖，并形成更多耐藥細(xì)胞克隆，這些結(jié)果均顯示miR-106b～25基因簇能降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。但不同于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族介導(dǎo)的經(jīng)典耐藥機(jī)制，miR-106b～25在mRNA水平未能提高M(jìn)DR-1基因的轉(zhuǎn)錄，在蛋白水平也不能提高P-gp的表達(dá)，即不能在短時(shí)間內(nèi)將藥物從細(xì)胞內(nèi)外排至細(xì)胞外，這也解釋了MCF-7-mirC細(xì)胞對(duì)于阿霉素在72 h的IC50相比于MCF-7-FUW并未有明顯升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-106b～25能夠提高M(jìn)CF-7細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞的比例。ALDH1高表達(dá)已被證實(shí)為乳腺癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記物之一，本研究中證明過表達(dá)miR-106b～25后ALDH1high細(xì)胞的比例從1.1%上升至2.7%，且微球體形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-106b～25基因簇促進(jìn)了乳腺癌干細(xì)胞特性，該結(jié)果與Simth等［16］的研究發(fā)現(xiàn)miR-106b～25過表達(dá)可增加MCF-7細(xì)胞中CD44+CD24－乳腺癌干細(xì)胞比例的結(jié)果相一致。

Fig 4 Overexpression of miR-106b～25 cluster on cancer stem cell-like characteristics of breast cancer cells

綜上所述，miR-106b～25基因簇可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞耐藥性形成，且該作用不是通過改變P-gp表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。MiR-106b～25基因簇增加乳腺癌細(xì)胞耐藥形成可能至少與促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞特性相關(guān)。

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