亮藍(lán)G對(duì)頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體介導(dǎo)心肌缺血損傷的作用研究

吳 炳，李桂林，涂桂花，彭海英，劉雙梅，彭力超，宋渺渺，梁尚棟，2

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330001)

頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglia，SCG)發(fā)出的節(jié)后纖維可影響心臟的功能［1－2］。SCG不是簡(jiǎn)單的信號(hào)中繼站，對(duì)傳入和傳出信號(hào)具有整合作用［3］。交感神經(jīng)的傳入纖維傳遞急性心肌缺血傷害性感受信號(hào)，進(jìn)而興奮中樞下達(dá)交感傳出信息對(duì)心臟功能產(chǎn)生影響。文獻(xiàn)顯示心臟的感覺(jué)傳入神經(jīng)元與頸上交感神經(jīng)節(jié)(SCG)神經(jīng)元之間存在相互聯(lián)系，通過(guò)頸上交感神經(jīng)節(jié)的節(jié)后神經(jīng)對(duì)心臟活動(dòng)產(chǎn)生影響，從而形成感覺(jué)傳入與交感傳出之間的反饋環(huán)路［4－5］。

嘌呤2受體(P2受體)包括 P2X受體亞型(P2X1-7)和P2Y受體亞型［6］。三磷酸腺苷(ATP)及其類(lèi)似物是P2受體的天然配體。P2X受體為非選擇性陽(yáng)離子通道，興奮時(shí)可引起通道開(kāi)放，可通透陽(yáng)離子 Na+、K+、Ca2+，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)［7］。ATP 作用于P2X受體調(diào)節(jié)神經(jīng)信息傳遞。由595個(gè)氨基酸組成的P2X7受體有395個(gè)氨基酸編碼的兩個(gè)跨膜區(qū)、包含一個(gè)N端和大的胞外環(huán)，P2X7受體位于胞內(nèi)的 C 端長(zhǎng)于其它亞型［5，8－9］。

我們實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P2X3和P2X2/3受體涉及心肌缺血損傷性信息傳遞并導(dǎo)致交感興奮反射［10］。P2X7受體存在于頸上交感神經(jīng)節(jié)［8］，P2X7受體參與多種神經(jīng)功能與病理變化［8］，但頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體是否與心肌缺血損傷相關(guān)尚不清楚。本研究通過(guò)觀察心肌缺血模型大鼠SCG中P2X7受體水平的變化與心肌缺血功能損傷的關(guān)系，及應(yīng)用P2X7受體特異性拮抗劑亮藍(lán) G(brilliant blue G，BBG)后的影響，了解急性心肌缺血損傷時(shí)頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體在損傷性信息導(dǎo)致交感興奮反射信號(hào)傳遞中的作用，為心肌缺血病變的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 心肌缺血實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與分組 健康Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，體質(zhì)量180－220 g，♀，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。大鼠心肌缺血模型建立方法［11］簡(jiǎn)述如下:麻醉后暴露大鼠的聲門(mén)，氣管插管后接通小動(dòng)物呼吸機(jī)。在左胸胸骨角第4肋間隙位置縱切皮膚，暴露心臟，用玻璃分針剌破心包膜。用小號(hào)縫合針快速穿刺血管底部心肌結(jié)扎左心耳與動(dòng)脈圓錐間的左冠狀動(dòng)脈前降支(深度約1.5～2.0 mm)，大鼠心電圖出現(xiàn)ST段呈弓背向上抬高時(shí)表明成功建立心肌缺血大鼠模型。

SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、假手術(shù)加BBG組、心肌缺血模型組和心肌缺血模型加P2X7受體拮抗劑BBG干預(yù)組。假手術(shù)加BBG組和心肌缺血模型加BBG干預(yù)組腹腔注射P2X7受體拮抗劑BBG(30 mg·kg－1·d－1)，分別連續(xù)注射 20 d。

1.2 藥品與試劑 兔抗P2X7單克隆抗體(Abcam公司)、β-actin抗體(北京中杉金橋)、亮藍(lán)G(brilliant blue G，BBG)(美國(guó)Sigma-aldrich)。

1.3 大鼠心電圖、血壓和心率測(cè)定 腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉。大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，將心電圖電極分別固定在雙上肢和右下肢皮下，進(jìn)而用Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)的心電圖。

應(yīng)用BP-2006A智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)假手術(shù)組、假手術(shù)加BBG組、心肌缺血模型組和心肌缺血模型加P2X7受體拮抗劑BBG干預(yù)組大鼠血壓和心率的變化。相同時(shí)間內(nèi)重復(fù)測(cè)量3次大鼠的血壓和心率后取其平均值，由同一人完成每次操作。

1.4 心肌酶測(cè)定 應(yīng)用抗凝玻璃毛細(xì)管在麻醉后大鼠的眶后靜脈叢采集約1～2 ml血液。將收集的血液立即離心5 min(3 000 r·min－1)后取上層血漿，用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)羅氏 COBAS E601)檢測(cè)各組大鼠血清心肌酶。

1.5 免疫組織化學(xué) 冰凍切片大鼠頸上神經(jīng)節(jié)，當(dāng)神經(jīng)節(jié)切片恢復(fù)至室溫后，用PBS(0.1 mol·L－1)洗3次(5 min/次);再用0.3%的H2O2室溫孵育5 min(以降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶);0.1 mol·L－1PBS洗3次(5 min/次);封閉液37℃ 孵育1 h;加入兔源并用0.1 mol·L－1PBS稀釋為1∶100的P2X7一抗后4℃ 孵育過(guò)夜;用0.1 mol·L－1PBS洗3次(5 min/次);滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液后37℃孵育 40 min;0.1 mol·L－1PBS 洗3 次(5 min/次);滴入適量過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(室溫孵育20 min);0.1 mol·L－1PBS洗3次(5 min/次);用DAB顯色、雙蒸水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片。

1.6 蛋白印跡 提取各組大鼠頸上神經(jīng)節(jié)提取蛋白，上樣及進(jìn)行SDS-PAGE蛋白分離電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。通過(guò)Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析目的條帶在X線膠片測(cè)得的綜合光密度值，以各組β-actin條帶的IOD值標(biāo)化其蛋白的表達(dá)量。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel及SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以±s表示，各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)采用方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 心率、血壓及心電圖的變化 心肌缺血大鼠模型組心率、血壓(收縮壓和舒張壓)與假手術(shù)組、假手術(shù)加BBG組、心肌缺血模型加P2X7受體拮抗劑(BBG)干預(yù)組大鼠比較出現(xiàn)明顯加快和增高(P＜0.05)。心肌缺血大鼠模型加BBG干預(yù)組的收縮壓、舒張壓與假手術(shù)組、假手術(shù)加BBG組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。心肌缺血大鼠模型加BBG干預(yù)組心率略高于假手術(shù)組和假手術(shù)加BBG組(P＜0.05)。見(jiàn)Tab 1。

心肌缺血成功建模大鼠的心電圖顯示ST段呈弓背抬高;建模20 d后心肌缺血大鼠模型的心電圖出現(xiàn)深大的病理性Q波，而心肌缺血模型加BBG干預(yù)組大鼠無(wú)明顯的病理性Q波(Fig 1)。

2.2 心肌酶濃度變化 應(yīng)用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)羅氏COBAS E601)檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)和心肌肌鈣蛋白T(cTn-I)。心肌缺血模型組的 LDH，CK-MB，CK和cTn-I濃度，與假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組和心肌缺血模型+BBG組比較明顯增加(P＜0.05)。心肌缺血模型+BBG組CK-MB、CK、LDH和cTn-I濃度較假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組略有增高(P＜0.05)。見(jiàn)Tab 2。

Tab 1 Value of heart rate and blood pressure(systolic blood pressure and diastolic blood pressure)after 20 days of myocardial ischemia in each group(±s，n=5)

Tab 1 Value of heart rate and blood pressure(systolic blood pressure and diastolic blood pressure)after 20 days of myocardial ischemia in each group(±s，n=5)

*P＜0.05 vs sham group，sham+BBG group and ischemia+BBG group;#P＜0.05 vs sham group and sham+BBG group.

Group Heart rate/min pressure/kPa Sham 332.850 ±36.720 15.928 ±1.591 11.268 ±1.Systolic blood pressure/kPa Diastolic blood 16.246 ±1.578 11.380 ±1.180 087 Sham+BBG 335.650 ±33.671 15.991 ±1.550 11.169 ±1.087 Ischemia 428.650 ±45.752*18.354 ±1.816* 12.443 ±1.228*Ischemia+BBG 389.870 ±38.961#

2.3 頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體免疫反應(yīng)性 用Image-Pro Plus軟件分析免疫組織化學(xué)結(jié)果，頸上交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞P2X7受體免疫反應(yīng)性的光密度值在假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組、心肌缺血模型組、心肌缺血模型+BBG組(n=10)分別為:205.015±20.98、198.52±20.06、403.76 ±41.29、223.83 ±24.36。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，心肌缺血模型組大鼠頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體蛋白的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組和心肌缺血模型+BBG組(P＜0.05);假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組和心肌缺血模型+BBG組之間P2X7受體蛋白的表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)Fig 2。

2.4 頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體的蛋白表達(dá) 將蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)β-actin標(biāo)化后顯示頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體蛋白表達(dá)的光密度值在假手術(shù)組、心肌缺血模型組、假手術(shù)+BBG組、心肌缺血模型+BBG組(n=10)分別為:0.98±0.09、1.46±0.13、1.03 ±0.09、0.90 ±0.08。心肌缺血模型組P2X7受體蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組、心肌缺血模型+BBG組(P＜0.05);假手術(shù)組、假手術(shù)+BBG組和心肌缺血模型+BBG組的P2X7蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)Fig 3。

3 討論

冠心病及心絞痛是由于心肌缺血和缺氧引起以心前區(qū)疼痛為主要臨床表現(xiàn)的一組綜合征［2，11］。頸部交感神經(jīng)對(duì)心功能興奮傳導(dǎo)、心跳頻率調(diào)節(jié)、心肌收縮和舒張具有重要作用。頸上交感神經(jīng)節(jié)不是單一的信息中轉(zhuǎn)站，它可以對(duì)心臟感覺(jué)信息的傳入信息與交感傳出信息進(jìn)行整合調(diào)控心臟的功能活動(dòng)［3－5，12］。本研究觀察到相對(duì)于假手術(shù)組大鼠，心肌缺血模型組大鼠的心率明顯加快、血壓明顯升高。頸上交感神經(jīng)節(jié)節(jié)后交感神經(jīng)末梢可分布于心臟與冠狀血管，急性心肌缺血、缺氧的損傷性感覺(jué)信號(hào)傳入后可以通過(guò)頸上交感神經(jīng)節(jié)節(jié)后交感神經(jīng)加強(qiáng)心臟的興奮性，導(dǎo)致心率加快、血壓升高和心交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)［4－5，12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌缺血大鼠模型心率加快、血壓升高，表明心肌缺血增強(qiáng)交感興奮性活動(dòng)。

冠心病及心肌損傷使心肌細(xì)胞破壞，使血中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白升高。乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)可作為觀察心肌缺血損傷程度的血清標(biāo)志物［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌缺血模型組大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)和心肌肌鈣蛋白T(cTn-I)升高明顯，表明心肌已出現(xiàn)損傷。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是一種高特異性、高靈敏度的心肌損傷標(biāo)志物。心電圖檢測(cè)觀察到心肌缺血模型組大鼠出現(xiàn)深大的異常Q波，表明出現(xiàn)明顯的心肌缺血損傷。

Fig 1 Representative traces of the ECG after 20 days of myocardial ischemia in each group

Tab 2Serum concentrations of LDH，CK-MB，CK and cTn-I after 20 days of myocardial ischemic injury in each group(±s，n=5)

Tab 2Serum concentrations of LDH，CK-MB，CK and cTn-I after 20 days of myocardial ischemic injury in each group(±s，n=5)

*P ＜0.05 vs sham group，sham+BBG group and ischemia+BBG group;#P ＜0.05 vs sham group and sham+BBG group.

Group CK-MB/U·L－1 CK/U·L－1 LDH/U·L－1 cTn-I/μg·L －1 Sham 37.87 ±3.87 480.85 ±47.76 292.85 ±28.83 0.052 ±0.0052 Sham+BBG 42.41 ±4.92 502.84 ±50.92 305.93 ±30.43 0.056 ±0.0043 Ischemia 84.30 ±8.82* 2125.84 ±204.52* 942.64 ±93.61* 0.192 ±0.0185*Ischemia+BBG 65.20 ±6.53# 856.38 ±85.73# 465.90 ±46.85# 0.078 ±0.0071#

Fig 2 Expression of P2X7in SCG tested by immunohistochemistry

Fig 3 Expression of P2X7protein in SCG tested by Western blot

P2X受體參與心血管功能調(diào)節(jié)及病理變化過(guò)程［6，14］。頸上交感神經(jīng)節(jié)存在 ATP 釋放［15］，組織損傷時(shí)可釋放大量 ATP［6］，進(jìn)而激活 P2X受體，加強(qiáng)心交感神經(jīng)傳出活動(dòng)。我們實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明心肌缺血模型大鼠頸部交感神經(jīng)節(jié)P2X3和P2X2/3表達(dá)明顯增加，交感興奮性增強(qiáng)［10］，應(yīng)用P2X3和P2X2/3受體拮抗劑A-317491可降低心肌缺血大鼠升高的血壓和加快的心率，由此表明頸部交感神經(jīng)節(jié)P2X受體涉及心交感反射。本實(shí)驗(yàn)觀察到缺血模型大鼠術(shù)后20 d出現(xiàn)心率加快和血壓升高，當(dāng)心肌缺血模型大鼠應(yīng)用P2X7受體拮抗劑BBG干預(yù)后可明顯降低升高的血壓和加快的心率，表明BBG可明顯抑制心肌缺血損傷引起心交感傳出神經(jīng)興奮性增強(qiáng)現(xiàn)象。心肌缺血模型大鼠應(yīng)用BBG預(yù)處理后心電圖的異常變化得到改善、心肌缺血模型大鼠血清的乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)和心肌肌鈣蛋白T(cTn-I)水平降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明P2X7受體拮抗劑BBG可能通過(guò)抑制心交感興奮反射對(duì)心肌缺血介導(dǎo)的心肌缺血性損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌缺血損傷后頸上交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X7受體的mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯增加，P2X7受體特異性拮抗劑BBG可降低上調(diào)表達(dá)的P2X7受體mRNA及蛋白水平。由此提示頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體參與心肌缺血損傷介導(dǎo)的心交感節(jié)后傳出興奮性反射的病理變化，P2X7受體拮抗劑BBG可降低頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X7受體mRNA及蛋白水平，抑制頸上交感神經(jīng)節(jié)節(jié)后神經(jīng)介導(dǎo)的交感興奮反射，降低心交感興奮反射引起的血壓升高和心率加快，從而對(duì)心肌缺血損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

總之，心肌缺血損傷導(dǎo)致頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體表達(dá)增加，大量釋放的ATP興奮P2X7受體，引起心交感興奮反射增強(qiáng)，出現(xiàn)心率加快和血壓升高而加重心肌缺血引發(fā)的損傷。P2X7受體拮抗劑BBG可通過(guò)降低頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體mRNA及蛋白的上調(diào)表達(dá)，對(duì)心肌缺血損傷介導(dǎo)的心交感興奮反射產(chǎn)生抑制作用，從而減輕心肌缺血損傷，對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。

［1］Pather N，Partab P，Singh B，Satyapal K S.The sympathetic contribution to the cardiac plexus［J］.Surg Radiol Anat，2003，25:210－5.

［2］Vaseghi M，Shivkumar K.The role of autonomic nervous system in sudden cardiac death［J］.Prog Cardiovasc Dis，2008，50:404 －19.

［3］Boehm S，Kubista H.Fine tuning of sympathetic transmitter release via ionotropic and metabotropic presynaptic receptors［J］.Pharmacol Rev，2002，54:43 －99.

［4］Armour J A.Myocardial ischaemia and the cardiac nervous system［J］.Cardiovascul Res，1999，41:41 －54.

［5］Armour J A.Potential clinical relevance of the‘little brain’on the mammalian heart［J］.Exp Physiol，2008，93:165 －76.

［6］Burnstock G，Krügel U，Abbracchio M P，Illes P.Purinergic signalling:from normal behaviour to pathological brain function［J］.Prog Neurobiol，2011，95:229 － 74.

［7］Jarvis M F，Khakh B S.ATP-gated P2X cation-channels［J］.Neuropharmacol，2009，56:208 －15.

［8］Sperlagh B，Vizi E S，Wirkner K，Illes P.P2X7receptors in the nervous system［J］.Prog Neurob，2006，78:327 －46.

［9］Volonté C，Apolloni1 S，Skaper S D，Burnstock G.P2X7receptors:channels，pores and more［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2012，11(6):705 －21.

［10］Li G L，Liu S M，Zhang J，et al.Increased sympathoexcitatory reflex induced by myocardial ischemic nociceptive signaling via P2X2/3receptor in rat superior cervical ganglia［J］.Neurochem Int，2010，9:84 －90.

［11］Higuchi T，Nekolla S G，Huisman M M，et al.A new 18F-labeled myocardial PET tracer:myocardial uptake after permanent and transient coronary occlusion in rats［J］.J Nucl Med，2008，49(10):1715－22.

［12］Zipes D P.Heart-brain interactions in cardiac arrhythmias:role of the autonomic nervous system［J］.Cleve Clin J Med，2008，75:S94－6.

［13］O’Neil B J，Ross M A.Cardiac markers protocols in a chest pain observation unit［J］.Emerg Med Clin North Am，2001，19:67 －86.

［14］Erlinge D，Burnstock G.P2 receptors in cardiovascular regulation and disease［J］.Purinergic Signal，2008，4(1):1 －20.

［15］Vizi E S，Liang S D，Sperlágh B，et al.Studies on the release and extracellular metabolism of endogenous ATP in rat superior cervical ganglion:support for neurotransmitter role of ATP［J］.Neuroscience，1997，79:893 －903.