DNA主動去甲基化酶研究進展及藥物開發(fā)

段 菊，凌 霜，甘我挺，孫 麗，許錦文

(上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203)

DNA主動去甲基化是表觀遺傳調(diào)控的一個重要過程，近幾年逐步明確了其機制、與疾病的關(guān)系、酶的活性和表達的影響因素。這些研究結(jié)果顯示，DNA主動去甲基化酶類不僅與胚胎發(fā)育過程相關(guān)，也同我們的日常生活中飲食營養(yǎng)(維生素C、D和鐵的攝取)、疾病過程(炎癥過程前列腺素E2的釋放)和激素水平(雌激素動態(tài)變化)有著密不可分的關(guān)系，也是未來藥物開發(fā)的關(guān)鍵酶類。

1 DNA去甲基化機制

DNA的去甲基化方式有被動去甲基化(replication-coupled DNA demethylation)和主動去甲基化 (active DNA demethylation)兩種。

1.1DNA被動去甲基化DNA被動去甲基化是指當(dāng)甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)活性被抑制或濃度過低時，無法維持原有的甲基化狀態(tài)，使DNA甲基化程度降低的過程。通常是在DNA復(fù)制過程中，當(dāng)序列特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA甲基化位點時，可能阻止DNMTs與這些位點的接近，導(dǎo)致DNA漸進地去甲基化。

1.2DNA主動去甲基化DNA主動去甲基化過程不依賴于DNA的復(fù)制，以5-甲基胞嘧啶 (5mC)為起始，在酶的催化作用下，使5 mC轉(zhuǎn)化為未甲基化的胞嘧啶(C)。盡管DNA主動去甲基化機制仍不十分清楚［1］，不同細胞內(nèi)或不同組織中DNA去甲基化的途徑還不明確，但目前主流觀點認為是由5mC的修飾開始，主要以脫氨基作用、氧化作用、甲基團脫氫過程實現(xiàn)(Fig 1)。

Fig 1 Schematic diagram of DNA active demethylation［1-3］

目前比較主流的認識有以下5種DNA主動去甲基化方式:

1.2.1氧化脫氨基偶聯(lián)堿基切除修復(fù)(BER)方式 這種方式需要3個步驟，5mC先經(jīng)過TET羥化酶氧化轉(zhuǎn)化為5-hydromethylcytosine(5hmC)，然后經(jīng)過 AID脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)?hmU，5hmU可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶TDG識別并切除，再通過BER最終將該位點轉(zhuǎn)化為C，實現(xiàn)DNA去甲基化。

1.2.1.1步驟1:羥化酶TET(ten-eleven translocation)人類和小鼠都擁有鐵依賴性氧化酶TET蛋白，人TET蛋白家族共有3名成員，分別為TET1、TET2和TET3。TET1是在研究1例存在t(10;11)(q22;q23)異位的白血病患者時作為組蛋白H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶MLL的融合伴侶而鑒定成功的，并由此而得名。TET1蛋白包含核定位序列，具有與DNA結(jié)合能力，因此主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮其生理作用。哺乳動物DNA中5hmC的發(fā)現(xiàn)推進了人們對其生物功能的廣泛探索［4］，其中最主要的是關(guān)注其在DNA主動去甲基化過程中的作用，大量實驗研究表明5hmC是DNA去甲基化過程中的中間產(chǎn)物，而其最直接的證據(jù)就是確定了TET1作為5mC羥化酶的作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)TET1蛋白在體外可以將5mC氧化成5hmC，且5hmC穩(wěn)定存在于胚胎干細胞及浦肯野細胞中，這提示5mC可能通過一個鐵依賴性氧化途徑經(jīng)由5hmC最終轉(zhuǎn)化成非甲基化的胞嘧啶。TET1敲低的小鼠胚胎干細胞中TET1通過將5mC轉(zhuǎn)化為5hmC調(diào)節(jié)DNA甲基化水平［4］，Guo等［6］提出 TET1高表達同樣也促進了人類細胞內(nèi)源性基因座區(qū)域特異性DNA去甲基化過程。

1.2.1.2步驟2:脫氨酶AID(activation-induced deaminase)

活化誘導(dǎo)脫氨酶AID是APOBEC(apolipoprotein B mRNA-editing，catalyticpolypeptide)家族中的一員，AID最初被確定是作為B淋巴細胞免疫球蛋白基因的類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)和體細胞高頻突變過程 (SHM)中的必需關(guān)鍵因子［7-8］。體外實驗和大腸桿菌中均證實AID能將單鏈DNA中胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在斑馬魚實驗中，AID能使5mC脫氨基變?yōu)門造成T/G錯配，這種錯配激活DNA修復(fù)通路BER，進而完成完整的去甲基化。同樣，在哺乳動物中，AID也參與了DNA主動去甲基化過程。據(jù)報道，AID-/-小鼠PGC基因組甲基化水平高于野生型，AID基因缺失主要影響內(nèi)含子、轉(zhuǎn)座子以及部分外顯子的去甲基化，而啟動子甲基化水平與野生型相當(dāng)［9］。利用RNA干擾技術(shù)阻斷人類成纖維細胞和小鼠ESC中的AID后，兩者融合形成的異核體中多能性相關(guān)基因Octz4和Nanog啟動子處于甲基化狀態(tài)，使Oct4和Nanog基因表達受到限制，表明AID可能在體細胞DNA甲基化重編程以及其多能性誘導(dǎo)過程中起重要作用，且AID依賴的去甲基化必然是主動的過程［10］。

1.2.1.3步驟3:糖苷酶TDG(thymine-DNA glycosylase)TDG是針對G/U錯配的糖苷酶，堿基修復(fù)BER途徑最上游的蛋白分子，實驗證明TDG可以將5hmC轉(zhuǎn)化為C［11］。

1.2.2氧化去甲基化偶聯(lián)BER方式 5mC先經(jīng)過TET羥化酶氧化轉(zhuǎn)化為5hmC，然后繼續(xù)在TET作用下氧化成 5-Form-lcytosine(5fC)，進一步又氧化成 5-Carboxylcytosine(5aC)，生成的5caC可被TDG識別并切除，在BER機制下也可實現(xiàn)該位點C的生成［12］。

1.2.3脫氨基化偶聯(lián)BER方式 脫氨酶使5mC脫氨基變?yōu)門造成T/G錯配，而T/G錯配可激活DNA修復(fù)通路完成完整的去甲基化過程。這個過程有兩類酶參與，MBD4(methylated DNA binding)和DNMT3。

MBD4對5mC同樣具有糖苷酶活性，但是其活性比其T/G錯配時的糖苷酶活性要低30-40倍左右，而蛋白激酶磷酸化后的胞嘧啶能增強MBD4對5mC的糖苷酶活性。MBD4缺失的受精卵仍表現(xiàn)出正常的合子父源DNA的去甲基化，并且，MBD4缺失小鼠不管其胞嘧啶是否被甲基化都表現(xiàn)出大量的C-T突變，提示其在去甲基化過程的有限性。斑馬魚胚胎的研究證明，AID與MBD4二者同時高表達，能促進DNA的去甲基化，而二者單獨高表達無此結(jié)果。相反，敲低MBD4引起DNA的再次甲基化［13］。

DNMT3是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族 (DNMTs)的一個成員，又分為DNMT3A和DNMT3B兩個亞型。盡管DNMTs一直被認為是催化DNA甲基化過程，但最近的研究報道DNMTs也參與到5mC脫氨基作用。起初是在細菌甲基轉(zhuǎn)移酶的研究過程中，發(fā)現(xiàn)它們具有脫甲基活性而參與到脫氨基過程。接著在哺乳動物的體外研究中發(fā)現(xiàn)DNMT3A和DNMT3B同樣具有脫甲基活性［20］，且報道指出 DNMT3A和DNMT3B能夠刺激TDG的酶活性并與之相互作用。DNMTs對于哺乳動物的生長發(fā)育是十分重要的，它們的功能異常將導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙、癌癥等多種疾病。因此，DNMTs可能成為一個重要的分子靶標(biāo)，在疾病的治療和預(yù)防中發(fā)揮重要作用。

1.2.4水解去甲基化方式 通過酶促反應(yīng)直接移除5mC上的甲基基團，MBD2酶(Methylated DNA binding domaincontaining protein 2)能過通過酶促反應(yīng)直接移除5mC上的甲基基團來實現(xiàn)去甲基化過程。完成DNA去甲基化最簡單的方式就是通過酶促反應(yīng)直接移除5mC上的甲基基團，而這需要有強烈的催化活性才能使牢固的C-C鍵斷裂。MBD2是第1個被報道能實現(xiàn)該過程的酶，不需要其他任何特定的因素而通過催化水解反應(yīng)直接從5mC上去除甲基團后釋放甲醇，但這種不利于熱力學(xué)的機制一直備受爭議。

1.2.5核苷酸外切修復(fù)方式(NER)針對由紫外線和致癌物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA螺旋扭曲損傷，NER核酸酶XPF和XPG酶切損傷附近的DNA片段，接著在DNA聚合酶的作用下C取代5mC，導(dǎo)致DNA甲基基團的丟失，從而實現(xiàn)DNA去甲基化。

2 DNA主動去甲基化相關(guān)酶類影響因素

參與去甲基化的酶或各種因子同樣受到機體環(huán)境的影響，這些影響因素直接作用于這些酶或因子，從而調(diào)節(jié)DNA的去甲基化過程。最新研究表明，雌激素、維生素D和C、前列腺素E2可以調(diào)控主動去甲基化酶的表達。

Pauklin等［7］通過實驗發(fā)現(xiàn)了AID基因的啟動子區(qū)域上雌激素受體的功能性結(jié)合位點，提出雌激素與雌激素受體復(fù)合物結(jié)合到AID啟動子上，促進AID mRNA的表達，進一步促進AID蛋白的表達。而Pauklin等［8］通過實驗證實黃體酮能夠結(jié)合AID啟動子抑制AID的表達，AID的表達的調(diào)節(jié)可受到雌激素和黃體酮恰好相反的作用。1，25(OH)2D3通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和DNMT3b的表達，下調(diào)細胞整體DNA甲基化水平［14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，維生素C可作為TET酶的輔因子從而促進5-hmC的生成，提示維生素可促進主動去甲基化酶的表達從而促進主動去甲基化過程［15］。Lee等［16］提出了增強COX-2通路蛋白的前列腺素2的前饋機制能夠逐步促進AID的mRNA及蛋白的表達水平，提示前列腺素E2可作為潛在主動去甲基化藥物發(fā)揮相關(guān)作用。

3 DNA甲基化和去甲基化與疾病的關(guān)系

DNA甲基化與DNA的去甲基化這兩個過程相互平衡，維持了DNA甲基化模式的穩(wěn)定。任何一方的失調(diào)都會導(dǎo)致DNA甲基化模式的紊亂和導(dǎo)致多種疾病和癌癥的發(fā)病過程，如阿爾采末病、炎癥、髓系惡性白血病和精神分裂癥。

3.1DNA甲基化和去甲基化與衰老的關(guān)系基因組DNA甲基化水平降低的趨勢在衰老中是普遍存在的。Szulwach等［17］提出在衰老過程中，哺乳動物大腦中的5hmC水平呈動態(tài)性變化，小鼠海馬DNA羥基化水平的增加亦是年齡相關(guān)的。與4月齡小鼠相比，衰老的24月齡小鼠大腦額葉皮層線粒體內(nèi)5hmC水平降低，5mC水平增加，表明衰老的線粒體哺乳動物大腦中的表觀遺傳機制的存在及其易感性［18］。同樣，老齡化還會導(dǎo)致人體B細胞內(nèi)AID表達水平的下降［19］。

3.2DNA甲基化和去甲基化與炎癥的關(guān)系DNA甲基化在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要調(diào)控作用，人天然脂蛋白誘導(dǎo)的DNA從頭甲基化與THP-1巨噬細胞炎癥基因的抑制相關(guān)［20］。炎癥性腸病相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)的變化可明顯改變疾病的發(fā)生發(fā)展過程中基因表達水平［21］。同樣，DNA主動去甲基化也參與到炎癥過程中，Neves-Costa等［22］證實TET1是IL-1β的負向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，胃腸組織中觀察到AID激活與各種炎癥相關(guān)，如慢性病毒性肝炎、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、巴雷特食管和炎性腸疾病等［23］。

3.3DNA甲基化和去甲基化與腫瘤的關(guān)系單基因水平及基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化改變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用。在許多腫瘤的研究中都發(fā)現(xiàn)了基因組整體DNA低甲基化所導(dǎo)致的染色體不穩(wěn)定性。抑癌基因的異常甲基化引起的表達抑制，可導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖失控和侵襲轉(zhuǎn)移，并參與腫瘤組織的血管生成過程。在各類型髓系惡性白血病中，TET2也是一個最常見的突變基因，有文獻證明TET2突變造成的酶活性破壞可導(dǎo)致骨髓生成異常而引發(fā)腫瘤發(fā)生［24］，在TET2突變體骨髓癌中，5-mC的羥化是不平衡的，而 TET1的表達增加可以抑制癌細胞的浸潤［25］，提示DNA主動去甲基化過程與癌癥密切相關(guān)。

3.4DNA甲基化和去甲基化與腦疾病的關(guān)系大腦新皮質(zhì)DNA異常甲基化已被認為可作為精神病的病理生理學(xué)因素［26］。精神分裂癥病人額前皮質(zhì)中顫蛋白基因RELN啟動子CpG島DNA的甲基化增強［27］，從而導(dǎo)致 RELN表達下降。在大腦以及浦肯野神經(jīng)細胞含有豐富的5hmC，而腫瘤細胞株中是不存在的，提示5hmC在大腦中具有表觀遺傳控制神經(jīng)元的功能作用［28］。精神病患者的頂葉皮層中TET1表達上調(diào)，而APOBEC3A和APOBEC3C的表達卻是下降的［29］。Gavin 等［26］提出在精神病中，GADD45b 可能會代償性的增加從而無法進入基因啟動子區(qū)域。這些理論都使得開發(fā)DNA主動去甲基化抑制劑來建立新的精神障礙治療方法變得可行。

4 去甲基化藥物的應(yīng)用與開發(fā)

DNA甲基化水平和模式的變化會導(dǎo)致生物的表型異常引發(fā)各種疾病，介于DNA甲基化的可逆轉(zhuǎn)特性，因此可以作為疾病治療的靶點。在這種理論的指導(dǎo)下，人們開始廣泛開發(fā)去甲基化藥物。

在很多腫瘤細胞中，都存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT異常過度表達。因此，通過抑制DNMT活性，阻斷DNA的高度甲基化來抑制或殺死腫瘤細胞這一思路已經(jīng)越來越多地受到科研工作者重視，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究也已成為藥物化學(xué)的一個研究熱點。目前已經(jīng)有兩個美國FDA批準(zhǔn)用于臨床的維持甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1的抑制劑，分別是5-aza-cytidine和5-aza-20-deoxycytidine，臨床用以治療骨髓增生異常綜合癥［30］。李洪利等［31］提出 5-Aza-dC 能夠逆轉(zhuǎn)A549細胞FHIT癌基因的去甲基化，且FHIT的mRNA及蛋白的表達恢復(fù)，提示5-Aza-dC在惡性腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景。

最新研究發(fā)現(xiàn)中藥單體姜黃素能有效抑制DNMT作用，姜黃素還可以誘導(dǎo)非白血性白血病細胞的DNA去甲基化。同時姜黃素對腫瘤細胞的異常甲基化亦有抑制作用［32］。姜黃素的發(fā)現(xiàn)為今后研究開發(fā)DNMT抑制劑提供了新型的骨架結(jié)構(gòu)，并有可能以此為先導(dǎo)化合物，開發(fā)出療效好毒性小的DNMT抑制劑，同時也為開發(fā)中藥運用提供新的思路。

DNA主動去甲基化通路在疾病治療中是一個極具潛力而又新穎的表觀遺傳治療干預(yù)的關(guān)鍵，參與DNA去甲基化過程的酶將作為一個重要的藥物分子靶標(biāo)，在藥物開發(fā)、疾病治療上顯示出極大的魅力，從疾病著手，從主動去甲基化關(guān)鍵酶著手，探索新的藥物將是一個挑戰(zhàn)。隨著研究的深入，對去甲基化藥物的探索研究亦可能將疾病的治療提升到新的高度。

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