秀麗隱桿線蟲作為抗感染藥物篩選模型的研究進展

史秋佳，楊劍萍，陳纘光

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

隨著抗生素廣泛和大量的使用，細菌對常用的抗生素出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，尤其是細菌多重耐藥性(multidrugresistant，MDR)問題變得日益普遍［1］，同時新上市的抗生素越來越少，這種情況促使人類必須不斷開發(fā)新的抗菌藥物，尋找新的抗菌靶點和藥物作用機制。細菌耐藥性導(dǎo)致患者病情惡化、醫(yī)療費用增加、病死率上升，耐藥菌的進一步發(fā)展可能使人類重新面臨感染性疾病的威脅［2］，“遏制細菌耐藥”曾成為2011年世界衛(wèi)生日主題。在研發(fā)新型抗菌藥的過程中諸多困難都可以通過對感染的活體動物模型研究來解決，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)作為模式生物具有諸多優(yōu)勢，因而受到眾多學者的關(guān)注。近年來，秀麗隱桿線蟲作為模式生物被廣泛應(yīng)用于生物學各個領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究，其中包括病原微生物與宿主自身免疫系統(tǒng)的研究和新抗菌藥開發(fā)。

1 秀麗隱桿線蟲作為模式生物的優(yōu)點

秀麗隱桿線蟲是分子生物學和發(fā)育生物學研究領(lǐng)域的一種經(jīng)典的模型動物，其作為生物模型極大地方便了生物學過程的觀察［3］。早在上世紀60年代，英國科學家Brenner選擇了秀麗隱桿線蟲作為研究細胞凋亡遺傳調(diào)控機制的簡單生物模型。Brenner，Sulston和Horvitz因在研究線蟲器官發(fā)育和尋找調(diào)控程序性細胞死亡過程的關(guān)鍵基因方面的杰出成就，分別獲得2002年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。Fire等［4］建立了線蟲RNA干擾技術(shù)，目前在生命科學的許多領(lǐng)域得到應(yīng)用，2006年，F(xiàn)ire和Mello因此而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

秀麗隱桿線蟲作為模型動物具有以下特點和優(yōu)點:①線蟲長度為1 mm，♀♂同體的野生型線蟲共包含959個體細胞［5］。通體透明，易觀察，實驗結(jié)果易放大，可在顯微鏡下看到線蟲體內(nèi)的器官如生殖腺、腸道等。由于體積小，適合放置于96孔板或者微流控芯片上進行研究，可用于高通量篩選(high throughput screening，HTS);②生死易判斷，正常線蟲在培養(yǎng)液內(nèi)呈正弦運動(Fig 1)，而被細菌感染導(dǎo)致死亡的線蟲體內(nèi)充滿細菌呈剛性桿狀(Fig 2)，僅用肉眼即可判斷線蟲生死;③易培養(yǎng)，它以大腸桿菌OP50為食，在20℃瓊脂平板培養(yǎng)。線蟲擁有復(fù)雜的化學感受系統(tǒng)，可以感受并反應(yīng)于許多化學成分。Beale等［6］的實驗顯示，秀麗隱桿線蟲可以利用細菌產(chǎn)生的氣味辨別食物源。并且，線蟲能夠在液體培養(yǎng)基中生存，這為高通量篩選帶來便利;④繁殖快，在實驗室20℃條件下，線蟲從受精卵發(fā)育為成蟲僅需3.5 d，平均壽命為3周，可縮短實驗過程的時間。多產(chǎn)，一條未經(jīng)交配的雌雄同體線蟲在其生殖期可產(chǎn)生大約300個受精卵;⑤與人類同源基因多，與人類疾病具有相關(guān)性［8］。由線蟲的中央數(shù)據(jù)庫wormbase(http://www.wormbase.org/)可知，現(xiàn)已知的秀麗隱桿線蟲藥靶基因與人類基因同源性達60%～80%［7］。由于線蟲和人類在許多基因和生物機制方面的高保守性，使線蟲成為體內(nèi)藥物篩選的優(yōu)秀模型。

Fig 1 Living nematodes maintain a sinusoidal shape

Fig 2 Dead nematodes appear as straight，rigid rods

2 研究進展

2.1秀麗隱桿線蟲感染模型的建立細菌致病機制和線蟲防御機制的研究是利用線蟲模型開發(fā)抗菌藥物的基礎(chǔ)和前提。作為一種簡單的模式宿主，線蟲可被多種人類病原菌感染和殺死。目前已利用線蟲作為模式生物研究的病原體有革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌［9］、糞腸球菌［10-11］、李斯特菌［12］，革蘭陰性菌銅綠假單胞菌［13-14］、沙門菌［15］等。

耐藥銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)是常見的院內(nèi)感染致病菌。通過制備耐藥銅綠假單胞菌感染秀麗隱桿線蟲平板，周雨朦等［16］建立線蟲-耐藥銅綠假單胞菌感染模型，并且在感染線蟲救治實驗中發(fā)現(xiàn)，可以排除毒性高、體內(nèi)外相關(guān)性差的化合物，線蟲感染模型適合用于篩選抑制耐藥菌生長和繁殖的化合物。陳麗紅等［17］建立了銅綠假單胞菌-線蟲感染模型，確立了最佳操作參數(shù)，并且研究了不同抗生素對線蟲存活時間的影響，得出了線蟲感染程度可量化操作的結(jié)論。

2.2利用秀麗隱桿線蟲感染模型研究細菌致病機制和線蟲免疫機制早期研究中，Garsin等［10］采用線蟲作為宿主模型來識別革蘭陽性細菌的毒力因子。作為對人類有致病性的革蘭陽性腸球菌，糞腸球菌(enterococcus faecalis)和屎腸球菌(enterococcus faecium)被用來做初步毒力鑒定。因為糞腸球菌和屎腸球菌都可以殺死線蟲的卵和幼蟲，然而如鼠傷寒沙門氏菌等革蘭陽性菌病原菌的致病性都沒有強到可防止線蟲下一代的孕育。由于缺少對后代的干擾，糞腸球菌和屎腸球菌簡化了線蟲作為宿主的病原菌研究。對于成蟲，糞腸球菌可以在線蟲腸內(nèi)繁殖達更高的滴度，導(dǎo)致持續(xù)的感染，并最終導(dǎo)致線蟲死亡。高滴度的屎腸球菌也可以在線蟲的腸內(nèi)累積，但是卻不會影響成蟲的壽命。他們采用了糞腸球菌感染線蟲模型，發(fā)現(xiàn)了兩個糞腸球菌毒力相關(guān)因子:tsr和ScrB。

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，作為革蘭陽性菌的代表，也同樣被用于建立秀麗隱桿線蟲的感染模型中。Sifri等［19］建立了金葡菌感染線蟲的模型，他們將線蟲放置在金葡菌環(huán)境中，幾天后線蟲死于消化道中金葡菌的增殖。由此，他們推測金黃色葡萄球菌毒力因子，例如agr和sarA，是一些哺乳動物發(fā)病的關(guān)鍵因素，并且一些缺失某些功能的線蟲突變體會對金黃色葡萄球菌易感。Irazoqui等［14］則拓展了Sifri等［18］的工作，研究了銅綠假單胞桿菌和金黃色葡萄球菌分別感染線蟲時不同的致病機制和宿主反應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞桿菌緩慢侵占線蟲腸道，產(chǎn)生與毒力因子相關(guān)的囊泡，并且在腸道細胞累積高電子密度生物被膜樣物質(zhì)，使腸道細胞變異。與此相反，金黃色葡萄球菌感染迅速，破壞微絨毛，溶解宿主細胞。線蟲被金黃色葡萄球菌感染時，會產(chǎn)生解毒反應(yīng)，盡量延長宿主的生存，這點和人類被金葡菌感染時的反應(yīng)相似。有些細菌經(jīng)熱滅活后，就失去了對于線蟲的致死性，但他們發(fā)現(xiàn)熱滅活的金葡菌可以感染線蟲，機制是金黃色葡萄球菌通過分泌出的有溶血活性的熱抵抗毒力因子使線蟲死亡。

McEwan等［19］發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌觸發(fā)秀麗隱桿線蟲腸道天然免疫力的分子機制。線蟲缺少專門的免疫細胞，因此腸道上皮細胞(IECs)完全充當了線蟲抵御銅綠假單胞菌的主要防御系統(tǒng)，當銅綠假單胞菌PA14積累在線蟲腸臟處時，可以引發(fā)宿主的機體損傷或抗微生物相關(guān)基因的表達量增加。ToxA(外毒素A)是90%以上臨床銅綠假單胞菌所表達的一種細菌毒素，當線蟲感染銅綠假單胞菌后，ToxA可以抑制線蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，他們通過一些研究證據(jù)證實了秀麗隱桿線蟲可以通過檢測并且識別ToxA介導(dǎo)的翻譯抑制劑來識別ToxA毒素，這種識別能力可以激活蠕蟲體內(nèi)部分依賴于免疫系統(tǒng)的潛在的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，而且可以激活諸如ZIP-2、PMK-1、MAPK、FSHR-1等抵抗銅綠假單胞菌感染的免疫能力。該研究闡釋了線蟲可通過識別銅綠假單胞菌的ToxA激活一系列免疫系統(tǒng)基因的表達來抵御銅綠假單胞菌的感染。

近年來，線蟲模型的發(fā)展推進了我們對于一些感染類疾病發(fā)病機制的理解，而對疾病本質(zhì)的深刻認識自然會為感染類疾病的治療提供啟示，同時也大大加速了新型抗生素的發(fā)現(xiàn)。Ewbank等［20］綜述了一些種族抗菌肽和蛋白質(zhì)，可作為候選新型抗生素。并且闡述了線蟲感染系統(tǒng)提供新型抗生素大規(guī)模體內(nèi)篩選的可能性。這些發(fā)現(xiàn)為新型抗菌療法提供了廣闊前景。

2.3利用秀麗隱桿線蟲感染模型研究新型抗菌藥物作用機制減弱細菌的毒力是抗菌藥物的研發(fā)的一個靶點，Ho等［21］通過感染秀麗隱桿線蟲研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌藥物雷洛昔芬可以強烈地抑制銅綠假單胞菌的毒力產(chǎn)生。使用該藥物對野生型銅綠假單胞菌作用，結(jié)果表明細菌產(chǎn)生的綠膿菌素水平明顯降低了。這些結(jié)果揭示了雷洛昔芬這種傳統(tǒng)用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥的內(nèi)分泌藥物或許可以用于開發(fā)出新型的療法來靶向治療銅綠假單胞菌的感染，這可能是細菌感染患者的一大福音。

近年關(guān)于銅綠假單胞菌中拮抗細菌群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)的研究已成為學者們的研究熱點。以抑制QS系統(tǒng)為靶標的分子抑制物，可以用于開發(fā)新的抗菌藥物。Sarabhai等［22］首次報道利用秀麗隱桿線蟲模型研究發(fā)現(xiàn)訶子果實中的鞣花酸衍生物具有拮抗QS系統(tǒng)，從而阻斷細菌細胞之間信號傳遞的作用。其機制為，下調(diào)QS系統(tǒng)中兩個重要基因lasIR和rhIIR的表達，并同時減少了革蘭陰性菌的信號分子AHL的表達，最終導(dǎo)致銅綠假單胞茵PAO1野生型的毒力的減弱并且提高了其生物膜對妥布霉素的敏感。

2.4利用秀麗隱桿線蟲感染模型篩選抗菌藥物的進展隨著越來越多耐藥菌株出現(xiàn)，新型抗菌化合物的發(fā)現(xiàn)速度相對變慢，化合物庫中很多物質(zhì)毒性大、體內(nèi)代謝差，而這些問題都可通過活體生物感染模型篩選來克服。線蟲能夠提供相對完整的實驗動物模型，又可避免小鼠模型的高價、耗時的缺點，因此可大幅降低藥物篩選的成本，是用于大規(guī)模藥物篩選的理想系統(tǒng)，近年來越來越多地受到科學家們的青睞。

Moy等［23］首次建立糞腸球菌感染的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗菌藥物篩選模型。他們采用瓊脂板培養(yǎng)線蟲，在96孔板上進行篩選操作，篩選了1 136種天然產(chǎn)物和6 000種合成化合物，發(fā)現(xiàn)16種化合物和9種提取物可延長被糞腸球菌感染的線蟲的壽命。他們發(fā)現(xiàn)篩選出的天然化合物中至少有2種物質(zhì)體外抗糞腸桿菌效果很差但是體內(nèi)有效;有些化合物體內(nèi)有效抑菌濃度可比體外有效抑菌濃度低很多;16種化合物中15種顯示無毒，有1種化合物可造成線蟲發(fā)育延遲。

雖然他們利用線蟲活體篩選抗菌化合物的試驗方法具有很多先進性，但是也有一些缺點，有很多重復(fù)性的人工操作，需要肉眼通過顯微鏡觀察判斷線蟲是否死亡，會耗費較多人力和時間。Moy等［24］隨后對方法進行了改進，建立了更加微型化和全自動化的384孔板采集分析的高通量篩選系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要由兩個設(shè)備組成:復(fù)雜對象分類篩選系統(tǒng)COPAS(complex object parametric analyzer and sorter)Biosort和自動圖像獲取處理系統(tǒng)。使用這個系統(tǒng)，他們篩選了共計37 000個化合物和天然提取物，發(fā)現(xiàn)了28種未被報道過的具有抗菌活性的化合物，其中有6種化合物在體外不影響病原菌的生長，說明它們可能阻止細菌毒力因子或是增強線蟲免疫功能，這和臨床上使用的抗生素具有完全不同的機制。他們的篩選流程如下:(1)用糞腸球菌感染同步化處理過的無菌成年線蟲;(2)將液體培養(yǎng)基分配至384孔板中;(3)利用COPAS Biosort將每個孔放置15條感染過的線蟲;(4)在26.3℃相對濕度85%條件下孵化5 d;(5)為了避免細菌干擾染色，用BioTek ELx405微孔清洗器洗去培養(yǎng)液中的細菌;(6)每個孔都加入SYTOX黃進行死細胞染色，只會染色死亡線蟲;(7)用MD Discovery-1自動顯微鏡獲取圖像;(8)用CellProfiler系統(tǒng)分析計算線蟲成活率。

Okoli等［25］建立了一個線蟲–白色念珠菌感染模型的高通量篩選抗真菌藥物系統(tǒng)。該系統(tǒng)可自動將白色念珠菌感染線蟲，并精確將線蟲分配到384孔板的孔中，省去了兩個相對耗費人工的步驟。他們利用這個系統(tǒng)篩選了1 948種生物活性化合物和通過多樣性合成的1 280種小分子化合物，發(fā)現(xiàn)了19種化合物具有抗真菌活性。其中7種是臨床已使用于抗真菌的藥物，12種未被用作抗真菌藥物，這12種新化合物中有3種是免疫抑制劑。

楊再昌等［26］采用銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌分別感染的秀麗隱桿線蟲模型，篩選了43種中藥的體內(nèi)抗菌療效，發(fā)現(xiàn)8種中草藥提取物在濃度為1 600 mg·L-1時均無體外抗菌活性，但是較低濃度(100～800 mg·L-1)時對線蟲產(chǎn)生會體內(nèi)抗菌作用。在抗生素遭遇限制使用的情況下，使用中草藥來治療感染性疾病或?qū)⒊蔀橹髁鳌?/p>

本課題組已經(jīng)開始基于微流控芯片的秀麗隱桿線蟲藥物篩選研究［27-28］，開發(fā)了一種新穎的微流控芯片裝置用于抗菌藥物篩選。采用常見的致病菌——金黃色葡萄球菌，作為病原菌去感染線蟲。致力于建立一種在線的全液體感染方法，得以在芯片上完成整個感染實驗。本方法相比傳統(tǒng)的感染方法，其明顯的優(yōu)勢體現(xiàn)在:液體的感染方法可以極大地簡化線蟲在不同培養(yǎng)板上反復(fù)接種、清洗和轉(zhuǎn)移等實驗程序，大大提高了實驗的效率［29］。

以上的研究表明，利用秀麗隱桿線蟲感染模型篩選抗感染藥物有體外藥物篩選所不具備的優(yōu)勢:(1)可以發(fā)現(xiàn)體外沒有抗菌活性但是有體內(nèi)活性的化合物，包括先導(dǎo)化合物，作用于致病菌毒力因子或者增強宿主免疫力的化合物;(2)由于判斷化合物是否有效是以線蟲是否死亡為標準，所以減少了大規(guī)?；衔锖Y選時篩選出有毒化合物或者體內(nèi)藥代動力學參數(shù)不佳導(dǎo)致的無效的化合物;(3)可以發(fā)現(xiàn)一些機制新穎、輔助抗感染的化合物。

3 總結(jié)和展望

當前細菌耐藥性的迅速上升和新抗菌藥的不斷減少形成了鮮明對比，新型抗菌藥物研發(fā)進入了瓶頸階段，開發(fā)新型抗菌藥物已成為當前醫(yī)藥界一個十分緊迫的任務(wù)。世界衛(wèi)生組織也呼吁各國政府和研究人員加大資金投入，加強能替代現(xiàn)有抗生素的新藥開發(fā)。傳統(tǒng)的動物模型，由于其存在時間長、操作繁瑣及費用高等缺點，在如今新抗菌藥物研發(fā)壓力下并不能很好的適應(yīng)整個研發(fā)環(huán)境的節(jié)奏。秀麗隱桿線蟲模型為篩選抗菌藥物提供了更好的平臺，為促進新抗菌藥的探索提供了一個更方便的工具。盡管線蟲與人類基因具有高度保守性，作為模型動物在抗菌藥物的體內(nèi)研究中表現(xiàn)出強大的優(yōu)勢，但畢竟線蟲和人類在生理、病理等方面差異較大，線蟲不具備完整的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、獲得性免疫系統(tǒng)，所以它不能完全代替其他哺乳動物模型進行藥物研究。由于線蟲無法在37℃下生存，所以限制了可研究的病原菌范圍。此外，線蟲具有強大的解毒系統(tǒng)，這依賴其細胞色素P450基因，這也限制了一些調(diào)節(jié)宿主防御的一些化合物的發(fā)現(xiàn)。目前秀麗隱桿線蟲模型在抗感染藥物篩選方面只能局限于初篩，新藥的發(fā)現(xiàn)還需要后續(xù)的動物試驗和臨床試驗。我們應(yīng)當正確認識秀麗隱桿線蟲在研究抗感染藥物方面的優(yōu)勢和不足，進行周密的實驗方案設(shè)計，確證線蟲病理模型與人類病理某一方面的一致性，才能充分發(fā)揮線蟲模型這個體內(nèi)抗感染藥研究和體外抗感染研究這座橋梁的價值。

秀麗隱桿線蟲作為優(yōu)秀的模型動物除了用于抗菌藥物的體內(nèi)研究，還被廣泛應(yīng)用于人類疾病模型的復(fù)制與干預(yù)、藥物新靶點的發(fā)現(xiàn)與證實、基因組學、毒理學、神經(jīng)生物學、遺傳與發(fā)育生物學、環(huán)境生物學等領(lǐng)域。可以預(yù)見，隨著人們對秀麗隱桿線蟲認識的不斷加深，這種小型的模型動物將在藥學領(lǐng)域發(fā)揮出更大的作用，為新藥的發(fā)現(xiàn)增加新的途徑。

［1］張亞妮，段康民.活性氧在細菌耐抗生素機制中的作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1129-31.

［1］Zhang Y N，Duan K M.Role of reactive oxygen species in mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1129-31.

［2］Wright G D.Antibiotics:a new hope［J］.Chem Biol，2012，19(1):3-10.

［3］Sifri C D，Begun J，Ausubel F M.The worm has turned-microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans［J］.Trends Microbiol，2005，13(3):119-27.

［4］Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391(6669):806-11

［5］Brenner S.The genetics of Caenorhabditis elegans［J］.Genetics，1974，77(1):71-94.

［6］Beale E，Li G，Tan M W，Rumbaugh K P.Caenorhabditis elegans senses bacterial autoinducers［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72(7):5135-7.

［7］Harris T W，Chen N，Cunningham F，et al.WormBase:a multispecies resource for nematode biology and genomics［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(Database issue):D411-7.

［8］張予陽，史琳琳，郝冬海，潘麗紅.Bcl-2在缺血性神經(jīng)細胞損傷中的作用及藥物的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):21-4.

［8］Zhang Y Y，Shi L L，Hao D H，Pan L H.The actions of Bcl-2 on anti-ischemic neuron injury and the effects of anti-ischemic drugs on Bcl-2［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):21-4.

［9］Sifri C D，Baresch-Bernal A，Calderwood S B，von Eiff C.Virulence of Staphylococcus aureus small colony variants in the Caenorhabditis elegans infection model［J］.Infect Immun，2006，74(2):1091-6.

［10］Garsin D A，Sifri C D，Mylonakis E，et al.A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(19):10892-7.

［11］Moy T I，Mylonakis E，Calderwood S B，Ausubel F M.Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium［J］.Infect Immun，2004，72(8):4512-20.

［12］Thomsen L E，Slutz S S，Tan M W，Ingmer H.Caenorhabditis elegans is a model host for Listeria monocytogenes［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72(2):1700-1.

［13］Tan M W，Rahme L G，Sternberg J A，et al.Pseudomonas aeruginosa killing of Caenorhabditis elegans used to identify P.aeruginosa virulence factors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(5):2408-13.

［14］Irazoqui J E，Troemel E R，F(xiàn)einbaum R L，et al.Distinct pathogenesis and host responses during infection of C.elegans by P.aeruginosa and S.aureus［J］.PLoS Pathog，2010，6(7):e1000982.

［15］Paulander W，Pennhag A，Andersson D I，Maisnier-Patin S.Caenorhabditis elegans as a model to determine fitness of antibiotic-resistant Salmonella enterica serovar typhimurium［J］.Antimicrob A-gents Chemother，2007，51(2):766-9.

［16］周雨朦，陳代杰，李繼安，等.秀麗隱桿線蟲-耐藥銅綠假單胞菌感染模型的建立［J］.中國抗生素雜志，2011，36(7):511-4.

［16］Zhou Y M，Chen D J，Li J A，et al.Establishment of an infection model using Caenorhabditis elegans-multidrug resistance P.aeruginosa［J］.J Chin Antibiot，2011，36(7):511-4.

［17］陳麗紅，孫利芹，王長海.利用秀麗隱桿線蟲構(gòu)建抗菌物質(zhì)體內(nèi)篩選模型［J］.煙臺大學學報(自然科學與工程版)，2012，25(2):117-21.

［17］Chen L H，Sun L Q，Wang C H.Establishment of an antibiotic screening model using Caenorhabditis elegans［J］.J Yantai Univ，2012，25(2):117-21.

［18］Sifri C D，Begun J，Ausubel F M，Calderwood S B.Caenorhabditis elegans as a model host for Staphylococcus aureus pathogenesis［J］.Infect Immun，2003，71(4):2208-17.

［19］McEwan D L，Kirienko N V，Ausubel F M.Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa exotoxin A triggers an immune response in Caenorhabditis elegans［J］.Cell Host Microbe，2012，11(4):364-74.

［20］Ewbank J J，Zugasti O.C.elegans:model host and tool for antimicrobial drug discovery［J］.Dis Model Mech，2011，4(3):300-4.

［21］Ho Sui S J，Lo R，F(xiàn)ernandes A R，et al.Raloxifene attenuates Pseudomonas aeruginosa pyocyanin production and virulence［J］.Int J Antimicrob Agents，2012，40(3):246-51.

［22］Sarabhai S，Sharma P，Capalash N.Ellagic acid derivatives from Terminalia chebula Retz.downregulate the expression of quorum sensing genes to attenuate Pseudomonas aeruginosa PAO1 virulence［J］.PLoS One，2013，8(1):e53441.

［23］Moy T I，Ball A R，Anklesaria Z，et al.Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(27):10414-9.

［24］Moy T I，Conery A L，Larkins-Ford J，et al.High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model［J］.ACS Chem Biol，2009，4(7):527-33.

［25］Okoli I，Coleman J J，Tampakakis E，et al.Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay［J］.PLoS One，2009，4(9):e7025.

［26］楊再昌，馬小彥，樂 意，等.用秀麗隱桿線蟲觀察43種中藥的體內(nèi)抗菌藥效［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(5):1174-5.

［26］Yang Z C，Ma X Y，Le Y，et al.The determination of antibacterial efficacy of 43 kinds of traditional Chinese medicinein vivostudy using C.elegans［J］.Lishizhen Med Mater Med Res，2010，21(5):1174-5.

［27］楊劍萍，楊 帆，李新春，等.基于微流控芯片的秀麗隱桿線蟲的研究進展［J］.生物化學與生物物理進展，2011，38(10):877-83.

［27］Yang J P，Yang F，Li X C，et al.Advances on biomedical research in caenorhabditis elegans based on microfluidic device［J］.Prog Biochem Biophys，2011，38(10):877-83.

［28］Yang J P，Chen Z G，Yang F，et al.A microfluidic device for rapid screening of chemotaxis-defective Caenorhabditis elegans mutants［J］.Biomed Microdevices，2013，15(2):211-20.

［29］Yang J P，Chen Z G，Ching P Y，et al.An integrated microfluidic platform for evaluatingin vivoantimicrobial activity of natural compounds using a whole-animal infection model［J］.Lab Chip，2013，13(17):3373-82.