廣西柳州地區(qū)羅非魚鏈球菌病病原藥敏性分析

黃 杰 羅福廣 楊 軍 左 躍 易 弋 黃 稀

（1.柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 柳州 545006；2.廣西工學(xué)院，廣西 柳州 545006；3.國家羅非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系柳州綜合試驗(yàn)站，廣西 柳州 545002）

隨著羅非魚規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷擴(kuò)大，其苗種、水產(chǎn)品流通日趨頻繁，加上養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和養(yǎng)殖戶規(guī)范用藥的意識薄弱，造成各種細(xì)菌病尤其是鏈球菌病在國內(nèi)呈迅速蔓延趨勢，并嚴(yán)重制約羅非魚產(chǎn)業(yè)化的健康可持續(xù)發(fā)展。據(jù)國內(nèi)外報(bào)道引發(fā)羅非魚病害的主要病原多為海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）和無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）[1-6]，發(fā)病征兆除一部分為無明顯癥狀和病變的急性死亡外，大多數(shù)病魚都表現(xiàn)為眼突或眼球白色渾濁的典型癥狀[7]。

養(yǎng)殖戶針對細(xì)菌病的防治，一般是通過使用各種抗菌藥物。長期使用、濫用、亂用現(xiàn)象屢見不鮮，細(xì)菌耐藥問題日益突顯。通過細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)實(shí)施針對單一型或者混合型細(xì)菌疾病的診療服務(wù)，在獸醫(yī)臨床診斷和指導(dǎo)用藥中已經(jīng)普遍應(yīng)用，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，大多數(shù)還是采用傳統(tǒng)的細(xì)菌病防治方法。本文通過紙片擴(kuò)散法（K.B法）[8]，從柳州地區(qū)患病羅非魚體內(nèi)分離病原菌并進(jìn)行藥敏性分析，為本地區(qū)鏈球菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

患病的羅非魚來自2012年廣西柳州地區(qū)10個暴發(fā)鏈球菌病的養(yǎng)殖場（編號依次為D1、D2……D10）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

血瓊脂平板、藥敏紙片分別購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司、杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 病菌分離純化

對眼突、水面轉(zhuǎn)圈獨(dú)游等典型鏈球菌病癥狀羅非魚的腦、腎、肝、脾取樣，劃線接種血平板后室溫培養(yǎng) 24h，挑取鏡檢為鏈狀球菌的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化，得到11個菌株。菌株依次編號為C1、C2……C11，菌株采集和養(yǎng)殖場情況見表1。

1.4 藥敏試驗(yàn)

純化培養(yǎng)后的細(xì)菌，無菌條件下用接種針刮取部分細(xì)菌小心均勻涂布到血瓊脂平板，用鑷子將藥敏紙片緊貼到培養(yǎng)基上，兩紙片中心距不少于25mm，紙片與邊緣距不少于15mm。室溫培養(yǎng)24h后測量抑菌圈大小，判定敏感度[9]。

表1 菌株采集和養(yǎng)殖場情況

2 結(jié)果

2.1 癥狀

長年均有發(fā)生，7～9月最為嚴(yán)重。病魚主要表現(xiàn)為浮頭、轉(zhuǎn)圈、獨(dú)游、蛙躍等，眼睛單側(cè)或雙側(cè)突出、白濁，部分體色發(fā)黑，肛門紅腫；解剖觀察肝呈土黃或蒼白色，膽、腎腫大，部分腹腔充水。

2.2 細(xì)菌分離和形態(tài)觀察

大多數(shù)病魚從腦、肝、腎接種24h后獲得色澤一致，在劃線位置形成細(xì)密排列的菌落。每個菌落圓形隆起，邊緣光滑呈乳白色，直徑0.5～2mm。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)均為陽性球菌，單個或鏈狀。

2.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

本次試驗(yàn)分離菌株對26種常見抗生素包括奎諾酮類、磺胺類、酰胺醇類、頭孢類等水產(chǎn)藥物或其他醫(yī)用藥物的敏感性檢測結(jié)果如表2所示，耐藥率在60%以上的有復(fù)方新諾明、鏈霉素、新霉素、氟哌酸、多粘菌素B、依諾沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶（鈉）、磺胺對甲氧嘧啶等藥物，復(fù)方新諾明、磺胺對甲氧嘧啶表現(xiàn)為最高（90.9%）。而頭孢類、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星、復(fù)方磺胺嘧啶、氟苯尼考、青霉素等藥物則檢測有一定敏感的頻率，敏感率最高為青霉素 G（36.4%）。從單個菌株來看，C4、C5對檢測的26種藥物有普遍的耐藥程度，分別為92.3%和69.2%，耐藥程度在40%以上的菌株，均來源于采集菌株一周前投喂過各種抗生素的養(yǎng)殖場。同一池塘不同時期采集的菌株，其藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果也不同，在分別投喂恩諾沙星，阿莫西林后，分離菌株C7檢測對26種藥物的耐藥率為46.2%，敏感率為0；停喂18天后分離菌株 C8檢測對 26種藥物的耐藥率為 15.4%，敏感率為53.9%。

表2 分離菌株對藥物敏感性的試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

羅非魚鏈球菌病是一種暴發(fā)性流行病，近年報(bào)道羅非魚鏈球菌感染的趨勢明顯增加，主要危害100g以上的幼魚和成魚，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率達(dá)10%～30%，死亡率達(dá)25%～80%[5]，病害的發(fā)生多與水溫高、養(yǎng)殖密度大、水質(zhì)差、投飼量大和飼料質(zhì)量差有較大關(guān)系，嚴(yán)重危害羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10]。近幾年年廣西柳州地區(qū)羅非魚鏈球菌病發(fā)生情況調(diào)查大致為：病害每年均有發(fā)生，水溫長時間高于28℃，養(yǎng)殖密度高、投喂過多飼料時通常會發(fā)生暴發(fā)性死亡，死亡以個體大、長速快的羅非魚居多。但調(diào)查發(fā)現(xiàn)了1例從海南引進(jìn)3～4cm的苗種發(fā)生暴發(fā)性鏈球菌病急性死亡，說明鏈球菌病有向著感染幼魚方向發(fā)展的趨勢。

發(fā)生鏈球菌病后，養(yǎng)殖戶首先采用的是傳統(tǒng)防治方法，即使用各種水產(chǎn)抗生素藥物如恩諾沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、復(fù)方磺胺二甲嘧啶粉等，但效果并不顯著。通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有分離菌株均有一定程度的耐藥性，養(yǎng)殖戶選取的抗生素藥物有極大的概率對病原菌不起作用，這可能是養(yǎng)殖戶使用藥物治療無效的主要原因之一。試驗(yàn)完成后，我們將實(shí)驗(yàn)結(jié)果及時反饋給養(yǎng)殖戶，并根據(jù)結(jié)果為養(yǎng)殖戶用藥提供指導(dǎo)。采用了敏感藥物進(jìn)行針對性治療后，死亡率大大降低。例如養(yǎng)殖戶在使用檢測敏感率高的水產(chǎn)青霉素藥物或其他有敏感性藥物3-5d后，每日死亡量為1、2尾或無，效果非常明顯。若出現(xiàn)鏈球菌病突然爆發(fā)，養(yǎng)殖戶來不及送樣進(jìn)行藥敏分析的情況，可以選擇青霉素進(jìn)行治療，因?yàn)樵谠囼?yàn)藥物中各菌株對青霉素的敏感率最高。此外，試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，具有普遍耐藥性的菌株，均來自長期、過量投喂單一藥物，或者頻繁換用藥物的養(yǎng)殖場。因此，建議養(yǎng)殖戶不要無目的的亂使用抗生素藥物，而應(yīng)在日常管理上通過注入地下井水、加深塘水、減少或不投喂餌料、適當(dāng)分塘養(yǎng)殖、長時間增氧等方法來防治鏈球菌病，這樣不但可以防止“超級細(xì)菌”的產(chǎn)生，同時也能避免抗生素殘留帶來的問題。

藥敏試驗(yàn)雖然能為養(yǎng)殖戶用藥提供科學(xué)指導(dǎo)，但仍有一定的局限性，例如水產(chǎn)病原菌藥敏試驗(yàn)沒形成標(biāo)準(zhǔn)，抗菌藥敏試劑少(如缺乏中草藥藥敏試劑缺乏等)，藥敏試驗(yàn)周期長（3d），需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件和操作技術(shù)。隨著國內(nèi)水產(chǎn)藥敏試驗(yàn)的重視和標(biāo)準(zhǔn)化的逐步建立，其條件、方法、效率等方面不斷改進(jìn)，藥敏試驗(yàn)將成為一種常規(guī)的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治手段，普遍應(yīng)用到現(xiàn)代化規(guī)模養(yǎng)殖中，科學(xué)指導(dǎo)和規(guī)范用藥，確保我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

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