沙苑子總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及其機(jī)制研究

侯 燕，馮一中，蔣小崗，顧振綸，毛新妍

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 蘇 州 215123;2.蘇州大學(xué)中藥研究所，江蘇 蘇州 215007;3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215004)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是一種肺損傷后較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制尚未明確［1］，其主要的病理改變?yōu)閺浡苑闻菅装Y、肺成纖維細(xì)胞灶的形成以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積［2－3］。近年來肺纖維化的發(fā)病率呈上升趨勢［4］，確診后平均生存時(shí)間為2～5年，60%的患者直接死于該病［5］，盡管國內(nèi)外對于該病的研究已取得了很大進(jìn)展，至今尚未發(fā)現(xiàn)治愈肺纖維化的藥物，因此，尋找新的有效的治療肺纖維化的藥物，成為國內(nèi)外共同關(guān)注的問題。

沙苑子總黃酮(total flavonoids from astragalus complanatus，F(xiàn)AC)是中藥沙苑子(shayuanzi)的干燥成熟種子中提取的有效成分。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatusR.Br)的干燥成熟種子，具有補(bǔ)益肝腎的功效，主要含有黃酮類、三萜類、有機(jī)酸等［6］。研究證實(shí)FAC具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗衰老等作用［7］，但FAC對大鼠肺纖維化的治療作用鮮見報(bào)道。本文采用博萊霉素滴注法制作大鼠肺纖維化模型，初步探討沙苑子總黃酮對肺纖維化的干預(yù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 沙苑子總黃酮，總黃酮含量為67%，由蘇州中藥研究所植化室提供，批號2012102;醋酸潑尼松龍片，5 mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司提供;博萊霉素A5，白色凍干粉末，15 mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號640110;總抗氧化能力(T-AOC)、羥脯氨酸(HYP)測定試劑盒，由南京建成生物工程公司供應(yīng);大鼠白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購于R＆D公司。

1.2 動物 清潔級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2009-005，飼養(yǎng)在清潔級動物觀察室，給藥期間自由飲水進(jìn)食。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，儀器編號:18-1650-01-016，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);H-1650臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CX31;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國艾本德股份公司生產(chǎn);XHF-D高速分散器(內(nèi)切式勻漿機(jī))，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);電子天平，PL203型，購于梅特勒公司。

2 方法

2.1 大鼠肺纖維化模型復(fù)制 腹腔注射4%的水合氯醛(0.1ml·kg－1)麻醉大鼠，固定頭部及四肢，使其仰臥于手術(shù)臺，常規(guī)消毒，沿頸部正中線做一切口，鈍性分離各層組織，暴露氣管，用1ml注射器刺入大鼠氣管軟骨環(huán)間隙，緩慢注入BLM A5(5 mg·kg－1，0.01 ml·kg－1)，正常對照組在相同條件下注入相應(yīng)體積生理鹽水。注入藥后立即將大鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3～5 min，使藥液分布均勻，然后縫合皮膚、消毒，大鼠清醒后送觀察室飼養(yǎng)。術(shù)前1 d及術(shù)后3 d，所有大鼠每天肌肉注射80萬U青霉素鈉(1 ml/只)。

2.2 動物分組和給藥 SD大鼠78只，隨機(jī)分為6組，稱重、編號，即正常對照組、模型組、陽性藥醋酸潑尼松組(3.34 mg·kg－1)、沙苑子總黃酮大劑量組(140 mg·kg－1，F(xiàn)AC-L)、中劑量組(70 mg·kg－1，F(xiàn)AC-M)、小劑量組(35 mg·kg－1，F(xiàn)AC-S)，每組大鼠13只。各組大鼠造模后，d 2開始每隔1 d稱重1次，按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積生理鹽水，陽性對照組灌服潑尼松(3.34 mg·kg－1)，各治療組分別給予不同劑量的FAC，連續(xù)給藥28 d。

2.3 檢測指標(biāo) 每組隨機(jī)取8只進(jìn)行血清及肺組織勻漿中總抗氧化能力(T-AOC)，肺組織勻漿中羥脯氨酸(HYP)含量的檢測，取剩余5只進(jìn)行肺泡灌洗，檢測肺泡灌洗液中IL-1β及IL-6的含量，各指標(biāo)檢測按照試劑盒說明書操作。

2.4 組織病理學(xué)觀察 取右肺下葉，用4%甲醛溶液固定，按病理學(xué)方法脫水、包埋、切片，進(jìn)行HE和Masson染色，光鏡下觀察肺泡炎、肺纖維化程度，參照Szapiel［8］的方法觀察肺泡炎程度并分級計(jì)分，采用Hubner等［9］的方法觀察肺纖維化程度并進(jìn)行評分。

2.5 組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 大鼠肺組織經(jīng)4%戊二醛，1%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，透射電鏡觀察。

2.6 沙苑子總黃酮對肺纖維化大鼠TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 提取組織蛋白，測定其濃度，各組加入60 μg蛋白樣本，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min后，按照分子量大小配制相應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗4℃結(jié)合過夜，加入二抗充分結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差與秩和檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示。

3 結(jié)果

3.1 FAC對大鼠肺纖維化的干預(yù)作用 與對照組相比，模型組大鼠肺組織勻漿中HYP的含量明顯上升(P＜0.01);與模型組相比，陽性藥醋酸潑尼松組和FAC各給藥組的肺組織勻漿中HYP含量明顯下降(P＜0.01)，見 Tab 1。

Masson染色結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡間隔明顯增寬，間隔內(nèi)見大量膠原沉積，提示纖維化形成;陽性對照組及FAC各給藥組鏡下觀察肺纖維化程度均有不同程度的減輕，參照Hubner等［9］的方法觀察肺纖維化程度并評分，見 Tab 2，F(xiàn)ig 1。

Tab 1 Effect of FAC on levels of HYP in lung tissue of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

Tab 1 Effect of FAC on levels of HYP in lung tissue of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 HYP/μg·g －1 Control － 0.98 ±0.07 Model － 1.40 ±0.16##FAC 140 1.19 ±0.15＊＊70 1.22 ±0.14＊＊35 1.24 ±0.11＊＊Prednisolone 3.34 1.20 ±0.14＊＊

Tab 2 Effect of FAC on alveolitis and fibrosis extent of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of FAC on alveolitis and fibrosis extent of pulmonary fibrosis rats(±s，n=8)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1Score of alveolitis Score of fibrosis Control － 0.62 ±0.51 1.28 ±0.48 Model － 2.50 ±0.50## 6.20 ±0.65##FAC 140 1.50 ±0.53＊＊ 3.03 ±0.58＊＊70 1.62 ±0.74＊＊ 3.45 ±0.76＊＊35 2.00 ±0.53* 4.45 ±0.54＊＊Prednisolone 3.34 1.75 ±0.70* 3.28 ±0.63＊＊

3.2 FAC對肺纖維化大鼠超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡觀察結(jié)果顯示:正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯改變;模型組Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞變性，細(xì)胞崩解脫落，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生，細(xì)胞內(nèi)板層小體明顯減少，胞腔內(nèi)空泡樣變，細(xì)胞線粒體明顯腫脹，見較多膠原纖維沉積。與模型組相比，潑尼松組及FAC各給藥組大鼠肺組織情況明顯改善，肺泡間隔纖維沉積減少，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞內(nèi)板層小體數(shù)量增多，表面微絨毛較豐富，線粒體腫脹減輕。見Fig 2。

Fig 1 Pathological observation of lung tissue in rats by Masson staining(Masson×100)

3.3 FAC對肺纖維化大鼠肺組織炎癥程度的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清中T-AOC的水平明顯降低(P＜0.01)，與模型組比較，潑尼松組與FAC各給藥組大鼠血清中T-AOC的能力明顯加強(qiáng)(P＜0.01或者P＜0.05)，見Tab 3。

與對照組相比，模型組大鼠肺組織勻漿中TAOC的含量明顯下降(P＜0.01)，與模型組相比，潑尼松組與FAC各給藥組的肺組織勻漿中的T-AOC能力明顯加強(qiáng)(P＜0.01或者P＜0.05)，見Tab 3。

與對照組相比，模型組肺泡灌洗液中IL-1β及IL-6的含量明顯升高(P＜0.01);與模型組相比，潑尼松及FAC各給藥組肺泡灌洗液中IL-1β及IL-6的含量明顯減少(P＜0.01或者P＜0.05)，見Tab 4。

HE染色顯示:正常對照組大鼠，肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔未見增厚，肺泡腔未見明顯改變;模型組大鼠:肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡間隔明顯增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生，陽性對照組及FAC各給藥組鏡下觀察炎癥均有不同程度的好轉(zhuǎn)，參照Szapiel等［8］的方法對肺泡炎程度進(jìn)行評分，結(jié)果見 Tab 2，F(xiàn)ig 3。

Fig 2 Electron microscope studies of lung tissue in pulmonary fibrosis rats

Fig 3 Pathological observation of lung tissue in rats by HE staining (HE×100)

Tab 3 Effect of FAC on levels of T-AOC of pulmonary fibrosis rats in serum and the lung tissue(±s，n=8)

Tab 3 Effect of FAC on levels of T-AOC of pulmonary fibrosis rats in serum and the lung tissue(±s，n=8)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 T-AOC/kU·L－1 in serum T-AOC/kU·L－1 in the tissue Control － 10.61 ±2.66 14.71 ±3.23 Model － 6.67 ±2.10## 9.52 ±1.64##FAC 140 9.47 ±1.49＊＊ 12.56 ±1.68＊＊70 8.95 ±1.04* 11.72 ±1.54＊＊35 8.76 ±1.14* 11.63 ±2.17*Prednisolone 3.34 9.54 ±2.60* 12.78 ±3.86*

Tab 4 Effect of FAC on levels of IL-1β，IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid of pulmonary fibrosis rats(±s，n=5)

Tab 4 Effect of FAC on levels of IL-1β，IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid of pulmonary fibrosis rats(±s，n=5)

##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1IL-1β/ng·L－1 IL-6/ng·L －1 Control － 6.64 ±0.93 15.78 ±1.13 Model － 8.56 ±0.97## 18.10 ±1.35##FAC 140 7.03 ±1.29＊＊ 15.09 ±1.72＊＊70 7.20 ±0.98* 15.73 ±2.50*35 7.21 ±1.59* 16.41 ±1.29*Prednisolone 3.34 7.11 ±0.73＊＊ 16.16 ±1.21*

3.4 FAC對肺纖維化大鼠肺組織中相關(guān)蛋白 α-SMA、TGF-β、Smad2表達(dá)的影響 與正常對照組相比，模型組肺組織中蛋白 α-SMA、TGF-β、Smad2的含量均明顯升高;與模型組相比，各給藥組中的α-SMA、TGF-β、Smad2 的含量明顯降低，見 Fig 4、5。

Fig 4 Expression of α-SMA，Smad2，TGF-β of lung tissue in pulmonary fibrosis rats

Fig 5 Analysis of the relative density value of α-SMA，Smad2，TGF-β in BLM-induced pulmonary fibrosis rats

4 討論

博萊霉素(BLM)是一種細(xì)胞毒性抗癌藥物，具有致肺纖維化的副作用［10］，以BLM復(fù)制肺纖維化動物模型被認(rèn)為是最近似于特發(fā)性肺纖維化病理改變的模型［11］。

羥脯氨酸(HYP)在膠原組織中占13.4%，彈性蛋白中含量極少，其他蛋白中均不存在，因此檢測肺組織HYP含量常用來反映膠原沉積情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠組織勻漿及血清中HYP的含量與對照組相比明顯增多;肺組織病理學(xué)觀察表明模型組大鼠肺組織中肺纖維化程度明顯加重;綜上提示本實(shí)驗(yàn)肺纖維化模型復(fù)制成功。本文實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)AC各給藥組，組織中HYP含量明顯減少，組織病理學(xué)觀察及超微結(jié)構(gòu)顯示FAC給藥組大鼠肺組織的肺纖維化程度明顯減輕，提示FAC有明顯的抗肺纖維化作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，氧化抗氧化失衡引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是肺纖維化發(fā)病重要機(jī)制之一，糾正體內(nèi)氧化抗氧化失衡可減輕肺纖維化的程度。在本文實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)AC給藥組中血清及組織勻漿中T-AOC的含量與模型組相比明顯升高，提示FAC可以提高組織抗氧化的能力。IL-1β及IL-6是炎癥因子，均具有致纖維化作用［12－13］，在本文實(shí)驗(yàn)中，各給藥組肺泡灌洗液中這兩種細(xì)胞因子的含量明顯降低，提示FAC有減輕炎癥反應(yīng)的作用;同時(shí)組織病理學(xué)HE染色結(jié)果也顯示FAC有減輕肺泡炎癥的作用。

細(xì)胞因子的相互作用是肺纖維化發(fā)病機(jī)制的另一重要因素，TGF-β是目前公認(rèn)的致纖維化因子，其作用途徑TGF-β/Smad信號通路在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用［14］。機(jī)體受到外界刺激時(shí)，TGF-β 活化，然后與 TGF-β 受體Ⅱ結(jié)合，TGF-β 受體Ⅱ自身磷酸化，進(jìn)而引起TGF-β受體Ⅰ胞內(nèi)近膜區(qū)的GS結(jié)構(gòu)域磷酸化而具有激酶活性，被激活的TGF-β受體可使下游的Smads蛋白(Smad2/3)磷酸化，后者可與介質(zhì)Smad4蛋白結(jié)合形成三聚體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，產(chǎn)生一系列的細(xì)胞綜合應(yīng)答［15］。表現(xiàn)為肺成纖維細(xì)胞(Fb)的增殖、平滑肌肌動蛋白-α(α-SMA)的表達(dá)增加，從而使成纖維細(xì)胞(Fb)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MFb)，還可使細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)及肺泡間過度沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展［14］。α-SMA作為 MFb的標(biāo)志性蛋白，其含量表達(dá)水平可以間接反映MFb的增值情況，也可間接反映肺纖維化的程度［16］。本文 Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織 α-SMA、TGF-β、Smad2的含量明顯增加，F(xiàn)AC各給藥組大鼠肺組織中的 α-SMA、TGF-β、Smad2的含量均明顯降低，提示博萊霉素可能激活了TGF-β/Smad信號通路，使肺組織中α-SMA、TGF-β、Smad2的含量明顯上升，而 FAC 有可能抑制了TGF-β/Smad信號通路，使肌成纖維細(xì)胞的生成減少，從而導(dǎo)致大鼠的肺纖維化程度降低。

綜上所述，在本文實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)AC對BLM致大鼠肺纖維化有一定的治療作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用、抑制炎癥細(xì)胞浸潤活化、減少膠原生成及調(diào)控TGF-β/Smad信號通路有關(guān)。

［1］Kikuchi N，Ishii Y，Morishima Y，et al.Aggravation of bleomycin－induced pulmonary inflammation and fibrosis in mice lacking peroxiredoxin I［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45(3):600－9.

［2］Wahers D M，Cho H Y，Kleeberger S R.Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis:a potential role for Nrf2［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10(2):321－32.

［3］Xu M，Deng B，Chow Y L，et al.Effects of curcumin in treatment of experimental puhnonary fibrosis:A comparison with hydrocortisone［J］.J Ethnopharmacol，2007，112(2):292－9.

［4］Wang Z L.Advances in understanding of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Chin Med J，2009，122(7):844－57.

［5］Antoniou K M，Alexandrakis M G，Siafakas N M，Bouros D.Cytokine network in pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Sareoidosis Vase Diffuse Lung Dis，2005，22(2):91－5.

［6］劉春宇，顧振綸，張克平，等.沙苑子黃酮對DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(1):110－3.

［6］Liu C Y，Gu Z L，Zhang K P，et al.Effect of flavonoids of astragali complanali on liver librosis induced by DMN in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(1):110－3.

［7］劉春宇，顧振綸，韓 蓉，等.沙苑子提取物對小鼠四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2002，33(12):1104－6.

［7］Liu C Y，Gu Z L，Han R，et al.Protective effect of extract in seed of Astragalus complanatus on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride in mice［J］.Chin Trad Herbal Drugs，2002，33(12):1104－6.

［8］Szapiel S V，Elson N A，F(xiàn)ulmer J D，et al.Bleomycin induced interstitial pulmona ry disease in the nude，athymic mouse［J］.AmRev Respir Dis，1979，120:893－9.

［9］Hubner R H，Gitter W，Mokhtari N E，et al.Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples［J］.Biotechniques，2008，44(4):507－17.

［10］Moeller A，Rodriguez-Lecompte J C，Wang L Q，et al.Models of pulmonary fibrosis［J］.Drug Discover Today:Disease Models，2006，3(3):243－9.

［11］Jack G，Geofrey J.Pulmonary fibrosis searching for model alswers［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2005，33:9－13.

［12］Agostini C，Gurrier C.Chemikine/cytokine cockail in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Proc Am Thorac Soc，2006，3:357－63.

［13］Wynn T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］.J Pathol，2008，214:199－210.

［14］Usuki J，Matsuda K，Azuma A，et al.Sequential analysis of myofibroblast differentiation and transforming growth factor-betal/Smad pathway activation in murine pulmonary fibrosis［J］.J Nihon Med Sch，2012，79(1):46－59.

［15］Huang T，David L，Mendoza V，et al.TGF-β signalling is mediated by two autonomously functioning TβRI:TβRII pairs［J］.EMBO J，2011，30(7):1263－76.

［16］馬榮林，王尉平，蔣小剛，等.黃芩總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(4):537－42.

［16］Ma R L，Wang W P，Jiang X G，et al.Effects of total flavonoids of scutellaria baicalensis georgi(TFSB)on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(4):537－42.