頭孢曲松對甲基苯丙胺致大鼠伏隔核神經(jīng)元和谷氨酸轉運體改變的影響

李成敏，顏 慧，王 玲，馬 萍，宮澤輝

(1.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850;2.第二炮兵總醫(yī)院藥劑科，北京 100088)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)，又名“冰毒”，是苯丙胺類興奮性毒品，具有很強的依賴潛能和致神經(jīng)細胞損傷作用。METH對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害遠大于海洛因等阿片類毒品［1－2］。目前研究認為［3－4］，METH 可以選擇性地作用于腦干以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位，主要作用部位是中腦－邊緣－多巴胺系統(tǒng)，其中樞損傷機制主要有3個方面:(1)多巴胺的氧化損傷機制;(2)線粒體功能紊亂;(3)谷氨酸的興奮性毒性。METH在激活多巴胺受體(dopamine，DA受體)的同時即可促進谷氨酸的釋放。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性遞質(zhì)之一，其興奮性毒性是由于胞外谷氨酸濃度增加過度激活受體引起的;胞外谷氨酸濃度的動態(tài)平衡是由谷氨酸轉運體精確調(diào)控的，囊泡膜谷氨酸轉運體1(vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1)和質(zhì)膜型谷氨酸轉運體1(GLT1)作為調(diào)控胞外谷氨酸濃度的最主要的物質(zhì)，在防治METH引起的神經(jīng)損傷中具有重要作用。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)［5－6］，嗎啡依賴大鼠GLT1的蛋白表達明顯降低;利用谷氨酸轉運體激動劑頭孢曲松(ceftriaxone，Cef)調(diào)控谷氨酸轉運體的表達，可明顯延緩嗎啡耐受的形成。本研究在METH急性/亞急性處理的大鼠模型上，同時利用頭孢曲松調(diào)控谷氨酸轉運體的表達，觀察METH致神經(jīng)損傷與谷氨酸轉運體的表達變化的關系。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠，SPF級，♂，200～240 g。購自軍事醫(yī)學科學院動物中心，動物合格證號:SCXK-(軍)2007－004，動物飼養(yǎng)于 SPF級動物房中，12 h黑/白交替，自由攝取食物和水。

1.2 藥品與試劑 METH(軍事醫(yī)學科學院楊征教授惠贈);頭孢曲松(生產(chǎn)批號:SH1150，上海羅氏);尼氏染色液(C0117，碧云天);抗體:豚鼠抗GLT1多克隆抗體(AB1783，Millipore)，豚鼠抗VGLUT1多克隆抗體(AB5905，Millipore)，兔抗β-actin多克隆抗體(sc-1616-R，Santa Cruz)，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(ZB-2301，中杉金橋公司)，HRP標記山羊抗豚鼠IgG(14-17-06，KPL);Cocktail酶抑制劑(04693124001，Roche);硝酸纖維素膜(Millipore公司);Easysee Western Marker(20-90 ku)(中國北京全式金生物技術有限公司);ECL發(fā)光液(北京普利萊生物有限公司);

1.3 主要儀器 MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋(日本SANYO公司)、TissuelyserⅡ高通量組織研磨儀(德國Qiagen公司);Sigma3-16PK型高速冷凍離心機(德國Sartrious公司);微型垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司);Gel Logic 1500 imaging systerm(美國Kodak公司);2800 UV/Vis分光光度計(美國Unico公司);CM1850型冷凍切片機(德國Leica公司)。

1.4 模型建立

1.4.1 甲基苯丙胺急性處理 取正常Wistar大鼠適應實驗環(huán)境后隨機分成2組(n=10)，即鹽水對照組和METH 40 mg·kg－1組。鹽水對照組動物腹腔注射生理鹽水 1.0 ml·kg－1，METH 40 mg·kg－1，單次腹腔注射。給藥后置于觀察盒中觀察其刻板行為，并記錄評分結果。

1.4.2 甲基苯丙胺亞急性處理 取正常Wistar大鼠適應實驗環(huán)境后隨機分成2組(n=12)，即鹽水對照組和METH 10 mg·kg－1組。鹽水對照組動物腹腔注射生理鹽水 1.0 ml·kg－1，METH 10 mg·kg－1，2次/天，連續(xù)4 d。每天上午給藥后置于觀察盒中觀察其刻板行為，并記錄評分結果。

1.4.3 行為學觀察 各組實驗動物均在給藥后密切觀察刻板行為并進行有關評分，10 min/次，觀察60 min，取平均值。模型組大鼠以實驗大鼠刻板行為評分≥2分為合格動物模型?？贪逍袨樵u分標準參考Sams-Dodd’s刻板行為評分標準［7］

0分，靜止不動，幾乎或根本無活動;1分，正?；顒?，偶爾有向前運動;2分，活動伴隨反復的向前探索，大鼠以一種刻板行為沿籠子周邊轉圈，且無其他行為;3分，繼續(xù)地向前探索;4分，重復地抬頭，搖頭或旋轉;5分，迅速地搖頭、旋轉或頭的背腹運動。

1.4.4 頭孢曲松預防給藥 對METH急性處理的干預:40只大鼠適應實驗環(huán)境后隨機分為4組(n=10)，即鹽水組(NS組)、頭孢曲松組(Cef組)、METH急性處理組(METH組)、頭孢曲松預防給藥組(Cef+METH)。頭孢曲松組大鼠腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg－1，3 次/天，連續(xù) 3 d;METH 急性處理組大鼠先腹腔注射生理鹽水1.0 ml·kg－1，2次/天，連續(xù)3 d，d 4 急性給予 METH 40 mg·kg－1;頭孢曲松預防給藥組大鼠先腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg－1，3 次/天，連續(xù)3 d，d 4 開始腹腔注射頭孢曲松后30 min再給予METH 40 mg·kg－1;鹽水組大鼠在相同時間內(nèi)腹腔注射等體積的生理鹽水，2次/天，連續(xù) 4 d。

對METH亞急性處理的干預:48只大鼠適應實驗環(huán)境后隨機分為4組，即鹽水組(NS組)、頭孢曲松組(Cef組)、METH亞急性處理組(METH組)、頭孢曲松預防給藥組(Cef+METH)。頭孢曲松組大鼠參考文獻劑量［8］，腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg－1，3 次/天，連續(xù) 7 d;METH 亞急性處理組先腹腔注射生理鹽水 1.0 ml·kg－1，2 次/天，連續(xù) 3 d，d 4 開始給予 METH 10 mg·kg－1，2 次/天，連續(xù) 3 d;頭孢曲松預防給藥組大鼠先腹腔注射頭孢曲松200 mg·kg－1，3 次/天，連續(xù)3 d，d 4 開始腹腔注射頭孢曲松后30 min再給予 METH10 mg·kg－1，2 次/天，連續(xù)3 d;鹽水組大鼠在相同時間內(nèi)腹腔注射等體積的生理鹽水，2次/天，連續(xù)7 d。

實驗動物在末次給藥后6 h，部分灌流切片，取伏隔核部位進行尼氏染色實驗;其余斷頭處死，取其伏隔核等組織，－70℃凍存，用于Western blot實驗。

1.5 尼氏染色法檢測尼氏小體的變化 冰凍切片(25 μm)置于室溫下空氣中晾干，新鮮蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮的蒸餾水再洗滌2 min;尼氏染色液染色12 min，蒸餾水洗滌2次，每次數(shù)秒;95%乙醇脫水2 min×2次;二甲苯透明5 min×2次;中性樹膠封片，晾干后于光鏡(×200)下觀察 ，細胞呈現(xiàn)為斑駁的藍(紫)色。采用專業(yè)分析軟件Image-Pro Plus.6分析紋狀體中尼氏小體的平均光密度值，每組3批次，取均值表示測定結果。

1.6 Western blot法檢測GLT1和VGLUT1蛋白表達量變化 組織按50 g·L－1比例加入0.32 mol·L－1的蔗糖溶液，并且加入cocktail蛋白酶抑制劑(10 g·L－1)，高通量組織電動勻漿，4℃下800×g離心24 min，取上清液，然后在4℃下19 000×g離心24 min后，棄去上清液，沉淀中加入150 μl Tris緩沖液溶解，4℃下19 000×g再離心17 min，上清液用作囊泡蛋白VGLUT1的Western blot分析;沉淀中加入80 μl Tris緩沖液，混勻，用作膜蛋白GLT1的Western blot分析［9］。測定蛋白濃度后煮沸變性5 min;而后SDS聚丙烯酰胺電泳，將膠轉移到硝酸纖維素膜上。膜以5%脫脂奶粉封閉2～4 h后，4℃下分別與一抗GLT1抗體(1∶3 000)、一抗VGLUT1(1∶1 000)及內(nèi)標 β-actin抗體(1∶3 000)輕搖孵育過夜;膜在TBS-T緩沖液中漂洗4次，每次室溫輕搖10 min。加入緩沖液稀釋的相應HRP標記二抗(1∶3 000)，室溫輕搖1 h。二抗雜交后的膜在TBS-T緩沖液中漂洗3次，TBS中漂洗1次，每次室溫輕搖10 min。與ECL化學發(fā)光試劑反應約1 min，凝膠成像儀下曝光成像，計算各組化學發(fā)光強度，每組3批次取均值表示測定結果。

2 結果

2.1 大鼠刻板行為評分結果 實驗室前期實驗結果顯示刻板行為評分結果與METH在一定劑量范圍內(nèi)(5、10、20、40 mg)呈正相關。參考文獻劑量并結合不同劑量組大鼠刻板行為評分情況，在急性毒性給藥實驗中將 METH 劑量確定為 40 mg·kg－1［10］。

頭孢曲松組大鼠在給藥后，正?；顒踊驘o活動，刻板行為不明顯;頭孢曲松預防給藥組在ip頭孢曲松 200 mg·kg－1后 30 min ip METH 40 mg·kg－1，5 min后出現(xiàn)不停的嗅探、轉圈等刻板行為，但搖頭和旋轉等癥狀減少或無此癥狀?？贪逍袨樵u分統(tǒng)計結果顯示，與鹽水對照組相比，METH組大鼠刻板行為評分明顯增加(P＜0.01)，約為鹽水對照組的3.7倍;與METH組比較，METH+Cef組大鼠刻板行為評分明顯下降(P＜0.01)，約為 METH組的67.5%;頭孢曲松組與鹽水對照組相比差異無顯著性(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ceftriaxone on stereotyped behavior of rats induced by METH acute treatment(±s，n=10)

2.2 伏隔核中尼氏小體的變化

2.2.1 頭孢曲松對METH急性毒性模型大鼠伏隔核中尼氏小體的影響 末次給藥后6 h將大鼠灌流固定，脫水后行冰凍切片進行尼氏染色實驗。采用專業(yè)分析軟件Image-Pro Plus.6分析伏隔核中尼氏小體的平均光密度值，進行比較其差異性。結果顯示急性ip給予METH 40 mg·kg－1，可導致伏隔核中尼氏小體明顯減少，與NS組相比，減少47.5%;頭孢曲松預防給藥組伏隔核中尼氏小體與METH組相比有增加的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見 Fig 2。

2.2.2 頭孢曲松對METH亞急性毒性模型大鼠伏隔核中尼氏小體的影響 末次給藥后6 h將大鼠灌流固定，脫水后行冰凍切片進行尼氏染色實驗。結果顯示亞急性腹腔注射METH 10 mg·kg－1，可導致伏隔核中尼氏小體明顯減少;預防給予頭孢曲松后，Cef+METH組紋狀體中尼氏小體與METH亞急性處理組相比有增加的趨勢，但差異沒有顯著性(Fig 3)。

2.3 Western blot檢測谷氨酸轉運體蛋白的表達變化

2.3.1 METH急性處理對 GLT1和 VGLUT1蛋白表達的影響 如 Fig 4所示，在伏隔核樣本中，METH急性處理后，與鹽水對照組相比，大鼠伏隔核中GLT1蛋白表達增加53.7%，頭孢曲松預防給藥后，與METH組相比，伏隔核中GLT1的表達增加約36%(P＜0.05)。

如Fig 5所示，在伏隔核樣本中，METH急性處理后，大鼠伏隔核中VGLUT1蛋白表達增加102%(P＜0.05);預防給予頭孢曲松后，伏隔核中VGLUT1蛋白的表達與METH組相比下調(diào)56%(P＜0.05)。

2.3.2 METH亞急性處理對 GLT1和 VGLUT1蛋白表達的影響 如Fig 6所示，樣品經(jīng)蛋白免疫印跡實驗檢驗，結果顯示，與鹽水對照組相比，METH亞急性處理后，伏隔核GLT1蛋白表達增加40.9%，統(tǒng)計學結果顯示差異有顯著性(P＜0.05)。頭孢曲松預防給藥后，GLT11蛋白表達與METH組相比下調(diào)14%，差異沒有顯著性(P＞0.05)。

如Fig 7所示，樣品經(jīng)蛋白免疫印跡實驗檢驗，結果顯示，METH亞急性處理后，METH組大鼠伏隔核中VGLUT1蛋白表達增加52.9%;頭孢曲松預防給藥后，VGLUT1蛋白表達水平是 METH組的101.9%，差異沒有顯著性(P＞0.05)。

3 討論

METH作用于中腦邊緣的DA系統(tǒng)，能夠引起中腦邊緣系統(tǒng)和黑質(zhì)的DA釋放增加，并且能激活谷氨酸能系統(tǒng)。DA和谷氨酸(glutamate，Glu)存在于相同的神經(jīng)元環(huán)路中，互相影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起大鼠刻板行為的改變。采用微透析技術發(fā)現(xiàn)，大鼠紋狀體中谷氨酸胞外濃度增加［10］;谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的興奮性氨基酸和興奮性遞質(zhì)，對正常腦功能和CNS的發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在谷氨酸能神經(jīng)傳遞過程中，VGLUT1將胞內(nèi)谷氨酸轉運至突觸囊泡中進行隔離、儲存、釋放，當神經(jīng)興奮到來時突觸囊泡相互靠近并與突觸前膜融合，將谷氨酸以胞吐形式釋放至突觸間隙［11－13］。釋放至突觸間隙的谷氨酸在激活谷氨酸受體的同時，被突觸前神經(jīng)末梢和鄰近的膠質(zhì)細胞膜上的GLT1攝取，迅速終止其作用(滅活)。

Fig 2Effect of ceftriaxone on Nissl body of nucleus accumbens in METH acute treated rats(±s，n=6－9)

2005年Nature雜志報道［14］頭孢曲松(200 mg·kg－1)通過激活GLT1基因的轉錄提高GLT1蛋白的表達，提高其生物學功能活性。而且在肌萎縮側索硬化癥ALS動物模型上，頭孢曲松能夠明顯延緩神經(jīng)元的損失;頭孢曲松能夠抑制可卡因、苯丙胺、甲基苯丙胺等藥物引起的依賴和其戒斷癥狀［15－17］。在前期實驗中，本實驗室也評價了部分β內(nèi)酰胺類抗生素對嗎啡耐受及依賴的作用，發(fā)現(xiàn)頭孢曲松(200 mg·kg－1)能夠上調(diào)GLT1的表達，緩解嗎啡耐受及痛敏［5－6］，所以在本實驗中選用頭孢曲松作為調(diào)節(jié)劑，其劑量也選用200 mg·kg－1。

在METH急性毒性實驗中，各組大鼠給藥后首先進行刻板行為行為學評價。結果顯示，頭孢曲松組與鹽水對照組相比，刻板行為評分結果差異無顯著性。METH組大鼠給藥后刻板行為明顯增加，評分結果與鹽水對照組相比，約為鹽水對照組的3.7倍;頭孢曲松預防給藥組大鼠的刻板行為評分與METH給藥組相比明顯減少，約為 METH組的67.5%。

Fig 3Effect of ceftriaxone on Nissl body of nucleus accumbens in METH sub-acute treated rats(±s，n=4)

在本實驗中，甲基苯丙胺急性給藥后Western blot結果顯示，甲基苯丙胺大鼠急性處理后伏隔核中GLT1和VGLUT1蛋白表達明顯上調(diào)，與鹽水對照組相比，增幅分別為53.7%和102%;甲基苯丙胺給藥后，伏隔核的胞外谷氨酸濃度明顯升高［4］，由于機體正反饋性的保護作用，正調(diào)節(jié)性的引起GLT1的蛋白合成增加，轉運胞外谷氨酸的能力增加，降低胞外谷氨酸水平，減小其興奮性毒性。頭孢曲松預防給藥組伏隔核中GLT1的表達與METH組相比明顯增加約36%;VGLUT1的表達與METH相比下調(diào)56%。VGLUT1是突觸前谷氨酸能終末的特異性標記物，突觸前VGLUT1的蛋白表達上調(diào)后，突觸前囊泡內(nèi)谷氨酸儲存增加，繼而谷氨酸釋放增加，加劇了胞外谷氨酸水平升高引起的興奮性神經(jīng)毒性頭孢曲松上調(diào)谷氨酸轉運體GLT1的表達，抑制VGLUT1的蛋白表達降低胞外谷氨酸水平，減少其興奮性毒性。

Fig 4 Effect of drug administration on protein expression of GLT1 in nucleus accumbens(±s，n=3)

Fig 5 Effect of drug administration on protein levels expression of VGLUT1 in nucleus accumbens(±s，n=3)

Fig 6 Effect of drug administration on protein expression of GLT1 in nucleus accumbens(±s，n=3)

Fig 7 Effect of drug administration on protein expression of VGLUT1 in nucleus accumbens(±s，n=3)

METH作用后，可導致海馬、紋狀體、皮質(zhì)等多部位廣泛的神經(jīng)細胞凋亡，造成記憶、認知和判斷能力的損傷［18］。Nissl小體存在于神經(jīng)元細胞質(zhì)中，可作為神經(jīng)元受損的標志。在本實驗中，尼氏染色結果顯示，METH急性處理后紋狀體中Nissl小體顯著減少，頭孢曲松預防給藥能緩解紋狀體中尼氏小體的減少。這可能是由于頭孢曲松提高谷氨酸轉運體的表達，降低胞外谷氨酸水平，減少谷氨酸的興奮性毒性引起的。

頭孢曲松通過激活谷氨酸轉運體的表達，使胞外谷氨酸水平降低，減少METH的興奮性毒性，緩解其神經(jīng)損傷，這一發(fā)現(xiàn)對于甲基苯丙胺致神經(jīng)損傷的研究有重要意義，為神經(jīng)精神類疾病的新藥研發(fā)提供一個新的靶點，也為臨床治療提供新的思路。

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