Bcl-2/Bad/mPTP通路介導14-3-3γ對抗脂多糖所致心肌損傷

劉 丹，彭易安，劉卓琦，湯 蕾，尹 東，何 明

(南昌大學1.醫(yī)學院藥理學教研室、2.醫(yī)學院生化教研室、3.第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學重點實驗室，江西 南 昌 330006)

14-3-3γ是14-3-3蛋白家族中的一個亞型，其作為細胞內(nèi)磷酸化作用的重要因子，參與多種病理生理過程。已有研究報道［1］，大鼠注射脂多糖(LPS)后，14-3-3γ mRNA表達明顯升高，提示其在提高心肌組織對損傷的反應(yīng)性以及作為修復信號等方面發(fā)揮重要作用。我們前期研究也已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染14-3-3γ重組質(zhì)粒至心肌細胞，能明顯對抗LPS所致的損傷，減少細胞凋亡，但是機制不明。越來越多的研究表明［2］，線粒體是心肌細胞中十分重要的細胞器，與凋亡密切相關(guān)。促凋亡信號作用于線粒體，可以改變線粒體膜的通透性，致使其內(nèi)的一些凋亡因子如細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、凋亡誘導因子(AIF)、核酸內(nèi)切酶等釋放至胞質(zhì)，從而啟動凋亡［3］。Bcl-2蛋白家族在調(diào)控線粒體通透性方面起關(guān)鍵作用，14-3-3蛋白可與Bcl-2蛋白家族中的Bad相互作用，使后者S112、S136位點磷酸化，從而導致Bcl-2/Bad異二聚體復合物解聚，Bcl-2游離，進而移位于線粒體外膜，通過調(diào)控線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)的開放來影響線粒體膜的通透性，在線粒體凋亡途徑中起關(guān)鍵作用［4］。14-3-3γ重組質(zhì)粒的抗LPS損傷的心肌保護作用是否與此途徑相關(guān)，目前尚未見報道。本實驗擬培養(yǎng)原代大鼠乳鼠心肌細胞，從Bcl-2/Bad/mPTP參與的線粒體凋亡途徑角度，探討14-3-3γ抗LPS損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 受試藥品與主要試劑 pFLAG-CMVTM-4質(zhì)粒:Sigma公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI、KpnI:NEB公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、凝膠回收試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒:Promega公司;14-3-3γ、Bcl-2、β-actin 抗體及相應(yīng)二抗:Santa Cruz公司;Bad、phospho-Bad(S112):Cell Signaling 公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;胞核-胞漿蛋白制備試劑盒:北京普利萊基因技術(shù)有限公司;MEM培養(yǎng)基:Gibco BRL公司;硝酸纖維素膜:Amersham公司;LPS(傷寒菌內(nèi)毒素脂多糖)、胰酶、HEPES、增強化學發(fā)光印跡試劑、丙烯酰胺、PMSF、亮肽素、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT:Sigma公司;其它試劑均為分析純。

1.2 14-3-3γ 真核表達載體 pFLAG-14-3-3γ 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 設(shè)計14-3-3γ擴增的PCR引物，并在引物中加入了EcoRI和Kpn兩個限制性酶切位點。上游引物:5'-AAGAATTCCCCCGCGAAGATG-3'，下游引物:5'-TTAGGTACCTGGGGCCTTAGTTGTT-3'。以SD乳鼠心肌細胞的cDNA為模板進行PCR擴增，然后酶切、連接、篩選，質(zhì)粒提取后，LipofectamineTM2000(μl)與 DNA(μl)以2.0∶0.8比例混合，轉(zhuǎn)染入心肌細胞，Western blot檢測14-3-3γ蛋白表達以評價轉(zhuǎn)染效率。

1.3 心肌細胞的分離培養(yǎng) 參照已發(fā)表的方法［5］，以出生1～3 d的SD乳鼠心室肌組織為實驗對象，0.1%胰酶消化分離，MEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)混懸后放CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)孵育2 h去除成纖維細胞，然后分別按5×105cells·well－1、1×105cells·well－1接種于 6 孔、96 孔培養(yǎng)板，隔天換培養(yǎng)液，前3 d加入0.1 mmol·L－1Brdu抑制纖維細胞生長。培養(yǎng)4 d隨機分組進行實驗。

1.4 實驗分組 細胞隨機分4組:(1)對照組(Control):未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及未經(jīng)LPS處理組;(2)LPS組:終濃度為10 mg·L－1的LPS加至培養(yǎng)液，孵育6 h;(3)pFLAG+LPS組:空載質(zhì)粒pFLAG轉(zhuǎn)染至心肌細胞中，24 h后處理同LPS組。(4)pFLAG-14-3-3γ+LPS組:重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ轉(zhuǎn)染至心肌細胞中，24 h后處理同LPS組。每組重復6次。

1.5 細胞存活率 MTT比色法檢測細胞存活率。胰酶消化細胞，每組細胞以1×104cells·well－1濃度接種至96孔培養(yǎng)板中。細胞融合至80%左右開始檢測。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT溶液(5 g·L－1溶于 PBS)，37℃，4 h，然后每孔加 DMSO 150 μl振蕩10 min，使藍色結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長處測定其光吸收值(OD值)。

1.6 生化檢測 各組處理結(jié)束后取上清200 μl，生化自動分析儀檢測LDH活性。

1.7 流式細胞法檢測心肌細胞凋亡 4℃預冷的PBS洗滌細胞 2次，加入 0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化、收集細胞，以 10 μmol·L－1DCFH-DA溶液500 μl重懸細胞，37℃孵育30 min，離心，800×g，5 min，棄上清，PBS 洗滌細胞 2 次，制成1×108cells·L－1的懸液，以488 nm為激發(fā)波長，以530 nm為發(fā)射波長，行流式細胞儀檢測。以不加DCFH-DA的一管為陰性對照。

1.8 mPTP開放檢測 參照試劑盒分離心肌細胞線粒體，線粒體腫脹實驗檢測mPTP的開放。520 nm波長測各組吸光度初值(OD1)，加入200 μmol·L－1CaCl2誘導mPTP開放，20 min后吸光度不再變化，記錄此時吸光度值(OD2)，△OD=OD1－OD2?！鱋D/min×100/%表示mPTP開放程度。

1.9 Western blot 實驗結(jié)束后，加入三去污劑裂解液裂解細胞，提取總蛋白，同等量蛋白質(zhì)完成SDS-PAGE后，進行電轉(zhuǎn)膜，再先后結(jié)合一抗和二抗，最后X線膠片曝光分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件行組間方差分析，各實驗組數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 pFLAG-14-3-3γ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS損傷后14-3-3γ蛋白表達的影響 LPS損傷處理使14-3-3γ蛋白表達較對照組明顯上調(diào)(P＜0.01);轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后行LPS處理，14-3-3γ蛋白表達與LPS處理組基本一致(P＞0.05);轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ后行LPS處理，14-3-3γ蛋白表達較之LPS處理組及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組上調(diào)(P＜0.01)，表明pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至心肌細胞(Fig 1)。

Fig 1 Effect of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on expression of 14-3-3γ protein in cardiomyocyte subjected to LPS injury(±s，n=6)

2.2 pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS損傷后心肌細胞存活率、LDH活性的影響 LPS處理使心肌細胞存活率明顯下降，LDH活性明顯升高(P＜0.01)。pFLAG-14-3-3γ轉(zhuǎn)染至心肌細胞后行LPS處理，與LPS處理組及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比較，心肌細胞存活率明顯升高，LDH活性則明顯下降(P＜0.01，見Tab 1)。

Tab 1 Effects of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on cell viability and LDH activity in cardiomyocytes subjected to LPS injury(±s，n=6)

Tab 1 Effects of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on cell viability and LDH activity in cardiomyocytes subjected to LPS injury(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs LPS group.

Group MTT(optical density)/% LDH/IU·L －1 Control 95.74 ±7.17 2.56 ±0.33 LPS 25.68 ±3.45＊＊ 37.38 ±4.16＊＊pFLAG+LPS 21.47 ±3.19＊＊ 40.21 ±4.37＊＊pFLAG-14-3-3γ +LPS 61.22 ±4.52## 21.57 ±3.45##

2.3 pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS損傷后心肌細胞凋亡的影響 LPS處理使凋亡的心肌細胞明顯增加(P＜0.01)，pFLAG-14-3-3γ轉(zhuǎn)染至心肌細胞后行LPS處理，較之LPS處理組或轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組凋亡的心肌細胞則明顯減少(P＜0.01，見Fig 2)。綜合Tab 1和Fig 2之結(jié)果，提示pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細胞能明顯提高心肌細胞對抗LPS損傷的能力。

Fig 2 Effect of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on apoptosis in cardiomyocyte subjected to LPS injury(±s，n=6)

2.4 pFLAG-14-3-3γ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對 LPS損傷后mPTP開放的影響 mPTP越開放，線粒體通透性隨之增加，線粒體腫脹加重，吸光度逐漸下降。LPS處理后，△OD/min值較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，提示LPS處理能使mPTP開放，線粒體通透性增加。轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3γ后，較之未轉(zhuǎn)染組或轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組，LPS所致的mPTP開放明顯被抑制，△OD/min值明顯下降(P＜0.01，見Fig 3)

Fig 3 Effect of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on mPTP opening in cardiomyocyte subjected to LPS injury(±s，n=6)

2.5 pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS損傷后心肌細胞Bad、phospho-Bad表達的影響 由Fig 4可得:各組Bad蛋白表達無差異(P＞0.05);LPS損傷組phospho-Bad蛋白表達與正常組相比亦無明顯變化(P＞0.05);轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒14-3-3γ之后，phospho-Bad蛋白水平明顯升高，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組或轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。提示重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ能促進Bad的磷酸化(Fig 4)。

2.6 pFLAG-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS損傷后心肌細胞線粒體Bcl-2表達的影響 LPS處理組與對照組相比，線粒體Bcl-2無明顯變化(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ組，較之未轉(zhuǎn)染組，線粒體Bcl-2表達明顯增加(P＜0.01)。提示pFLAG-14-3-3γ重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染能促進Bcl-2的線粒體移位(Fig 5)。

Fig 4 Effect of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on expression of Bad and phospho-Bad protein in cardiomyocyte subjected to LPS injury(±s，n=6)

Fig 5 Effect of recombinant plasmid pFLAG-14-3-3γ on expression of Bcl-2 protein of mitochondria in cardiomyocyte subjected to LPS injury(±s，n=6)

3 討論

當心肌細胞遭受損傷時，線粒體膜的通透性發(fā)生改變致使其內(nèi)的凋亡物質(zhì)釋放入胞質(zhì)中，在決定細胞命運過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用［6］。其中，線粒體的通透性主要由mPTP調(diào)控［7］。mPTP是一個跨膜、多蛋白復合物孔道，主要由電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)、腺苷酸轉(zhuǎn)位子(adenine nucleotide translocator，ANT)、親環(huán)蛋白D(cyclophilin D)等構(gòu)成的蛋白復合物，是線粒體內(nèi)外信息交流的關(guān)鍵，也稱為線粒體的刺激感受器［8］。當外界刺激造成mPTP大量(或長時間)開放，造成線粒體基質(zhì)呈高滲狀態(tài)，出現(xiàn)基質(zhì)腫脹［9］。由于線粒體的外膜面積遠小于內(nèi)膜，當mPTP大量(或長時間)開放，出現(xiàn)明顯的基質(zhì)腫脹，并造成嵴伸展，最終會引起外膜的破裂和線粒體不可逆的損傷，從而使膜間隙中的促凋亡蛋白釋放至胞質(zhì)，通過啟動半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)依賴性或非依賴性的級聯(lián)反應(yīng)機制，誘導細胞凋亡或者壞死［10］。本實驗已證實，LPS損傷會使mPTP開放，線粒體吸光度下降，△OD/min值升高。而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ以后，mPTP開放被抑制，損傷大大被減輕。

14-3-3蛋白是存在于幾乎所有生物體細胞中的一類重要蛋白質(zhì)家族，作為細胞內(nèi)磷酸化作用的重要因子，參與許多病理生理的調(diào)節(jié)過程［11］。已有研究證實14-3-3可使Bad蛋白S112、S136位點磷酸化，從而釋放出Bad/Bcl-2二聚體中的Bcl-2，游離的Bcl-2移位至線粒體，對線粒體的通透性起調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，LPS損傷雖可在一定程度上調(diào)心肌細胞14-3-3γ蛋白內(nèi)源性的表達，但是對phospho-Bad、線粒體Bcl-2卻無明顯影響。據(jù)此，可以推斷LPS損傷雖可誘導14-3-3 γ蛋白內(nèi)源性表達小幅度的上調(diào)，但是僅作為細胞對外源性刺激的一個應(yīng)激反應(yīng)，其不足以對抗LPS所造成綜合損傷，至少無法發(fā)揮其磷酸化Bad蛋白功能及其后續(xù)的功能學之作用;而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ之后行LPS損傷，phospho-Bad表達水平升高，線粒體Bcl-2增加，同時mPTP開放被抑制，細胞損傷明顯減輕，則提示外源性的14-3-3γ基因的導入，不僅在表達水平上進一步上調(diào)14-3-3γ，且具有良好的磷酸化BadS112之作用及其增強心肌細胞對抗LPS損傷之能力。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果證實了LPS所致的心肌細胞損傷不依賴于Bad/Bcl-2對線粒體通透性的影響，但是轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFLAG-14-3-3γ，可通過增加對Bad的磷酸化，使更多的Bcl-2移位至線粒體，從而對抗LPS損傷所致的心肌細胞損傷。

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