非小細胞肺癌中EGFR基因突變及靶向藥物治療研究進展

王 榮，石冬琴，，謝 華，李文斌，田 薇，賈正平

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院臨床藥理基地，甘肅蘭州 730050;2.浙江農林大學林業(yè)與生物技術學院，浙江 臨安 311300)

目前，肺癌依然是導致人類癌性死亡的首位疾病，全球每年因肺癌死亡的人數超過100萬，其中80% ～90%的患者為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)［1］。近年來，雖然肺癌的檢測方法學及治療手段不斷改進，但對大多數肺癌患者的預后并沒有明顯改善，經統(tǒng)計5年生存率僅為10% ～15%［2］。于是，靶向治療走入人們的視線，通過服用靶向藥物來延長患者的生存期。目前，應用EGFR-TKI進行肺癌的靶向治療相關研究最為廣泛。有研究表明EGFR突變在女性、非吸煙者、腺癌這些患者群體中優(yōu)先出現(xiàn)，而這些特征被證實可以預測吉非替尼在肺癌試驗中易瑞沙生存評價［3－4］。本文就EGFR突變及其與臨床病理特征、靶向藥物治療及臨床意義的相關性進行綜述。

1 EGFR基因突變臨床意義

1.1 EGFR的生物學特征及其信號轉導 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是屬于酪氨酸激酶I型受體家族，其家族成員主要包括EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4四種同源受體?；蚨ㄎ挥谌说?號染色體的短臂，含有28個外顯子。EGFR研究發(fā)現(xiàn)廣泛分布于各種上皮細胞的細胞膜上，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)三個部分。目前報道EGFR配體有:表皮生長因子 ( EGF)、轉化生長因子-(TGF-)、結合肝素的 E GF、雙調蛋白、B-cellulin 等［5］。EGFR主要信號轉導途徑有:RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路、PLC-γ 通路、PI3K-PDK 通路和 J AK-STAT 通路［6］。

1.2 EGFR在NSCLCL中的基因突變 EGFR的基因突變主要發(fā)生在胞內TK區(qū)域前四個外顯子之上(18～21)，目前報道發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30多種［7］(Fig 1)。

主要的突變有［8］:在外顯子19處的缺失突變、在密碼子719處的點突變(GT19X)、在外顯子20處的插入突變、在外顯子221-aminosteroid。而在外顯子l9處的缺失突變包括從亮氨酸-747到谷氨酸-749，定位于酪氨酸激酶C螺旋區(qū)N端，該缺失約占44%。在外顯子20處出現(xiàn)的突變約占5%，G719X占4%。在外顯子21處的點突變是最常見的EGFRTK區(qū)點突變，約占41%。劉紅梅等［9］對收集到的31例晚期NSCLC患者的腫瘤組織標本，檢測了EGFR酪氨酸激酶域基因突變，其結果表明共檢測出12例基因突變，4例為19號染色體缺失突變，其中3例病例為2 235～2 249核苷酸缺失造成E746～A750氨基酸改變，1例病例為2 240～2 257核苷酸缺失，而造成了L747～P753insS氨基酸改變。8例病例為2l號染色體錯義突變，均為L858R(T＞G)變異，但l8及20號染色體未見突變。Tokumo等［3］報道，在120例外科手術切除的NSCLC樣本的18～21外顯子檢測中發(fā)現(xiàn)大多數EGFR突變?yōu)?9外顯子缺失和21外顯子的點突變(L858R)，這些突變可引起EGFR酪氨酸激酶的活性增強，同時啟動不同的信號轉導途徑。研究表明［10］EGFR在43%～89% 的非小細胞肺癌(NSCLC)中表達為上調，其在腫瘤的形成及其介導瘤細胞的生物行為中發(fā)揮著重要的作用，是治療NSCLC的重要靶點之一，因此，研究 EGFR突變在NSCLC發(fā)病中的具體作用機制對EGFR-TKI的治療、預后及生存期有至關重要的意義。

Fig 1 EGFR mutations in non-small cell lung cancer

2 EGFR基因突變與臨床病理特征的關系

目前的研究發(fā)現(xiàn)表明［11］EGFR突變與性別、種族、吸煙、病理類型有關，在東方人群、女性、非吸煙、腺癌的患者中變異發(fā)生率較高。

Toyooka等［12］研究了311例 NSCLC切除樣本，檢查其EGFR19和21外顯子的突變情況。此外，還對431例NSCLC樣本進行了EGFR突變和臨床因素(年齡、性別、吸煙狀態(tài)、組織學、病程和生存情況)的可能相關性進行了研究。進行單變量分析，發(fā)現(xiàn)EGFR突變在女性、非吸煙者和腺癌患者的組織中的檢出率否認分別要比男性、吸煙者、非腺癌患者的組織中的檢出率高。進行多變量分析，發(fā)現(xiàn)非吸煙、腺癌組織和EGFR突變存在有重要的聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)和其他報道相一致，證實同類型人不存在選擇差異性。

張靜等［13］應用顯微切割技術及蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplification refractory mutation system，Scorpions ARMS)檢測170例NSCLC石蠟包埋腫瘤組織中EGFR基因第18、19、20和21外顯子突變。腺癌、鱗癌和大細胞癌EGFR基因突變的檢出率分別為:60.3%(82/136)、0(0/24)和20%(2/0)，結果顯示:腺癌患者中EGFR基因突變率明顯高于鱗癌及大細胞癌患者，腺癌與非腺癌EGFR基因突變比較其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);136例腺癌中細支氣管肺泡癌(15/22)和其他類型腺癌(67/114)的EGFR基因突變率比較，其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。通過比較EGFR基因突變與NSCLC各臨床病理特征的關系，表明EGFR基因突變常見于女性、不吸煙、腫瘤較小(≤3 cm)且分化程度較好者(P＜0.05)，但EGFR基因突變與患者的年齡、淋巴結是否轉移及疾病pTNM分期等則無相關性(P＞0.05)，見 Tab 1。

表1 非小細胞肺癌組織中EGFR基因與臨床病理特征的關系

綜上所述:EGFR基因突變與性別、種族、吸煙、腺癌、腫瘤大小、分化程度有一定的相關性。因此研究EGFR基因突變與臨床病理特征的關系有助于指導臨床用藥、個體化治療、手術預后以及延長肺癌患者的生存期。

3 EGFR基因突變與相關靶向藥物治療

基于EGFR在腫瘤細胞中的突變，針對EGFR的特異性分子治療NSCLC靶向藥物已被研究并廣泛應用于臨床。主要靶向藥物有兩大類:一類是小分子酪氨酸激酶抑制劑(簡稱TKI)，其進入細胞內，并直接作用于EGFR的胞內區(qū)，從而干擾三磷酸腺苷(ATP)結合，抑21 bp氨酸激酶磷酸化，代表性的藥物如吉非替尼(gefitinib，Iress)和厄洛替尼(erlotinib，Tarcev)。另一類是單克隆抗體(簡稱單抗)，其作用于胞外區(qū)，競爭性地抑制配體與EGFR的結合，從而使受體失去活性，影響細胞的生長，代表性的藥物如西妥昔單抗(Cetuximab，Erbitux)。

目前許多研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變與小分子酪氨酸激酶抑制劑的療效相關，其中研究較多的是吉非替尼和厄洛替尼。Tokumo等［3］對21例給予吉非替尼治療的患者研究發(fā)現(xiàn)，攜帶EGFR突變的腫瘤病人對藥物的反應明顯較高。日本、韓國、中國臺灣、新加坡及中國內地的研究表明［14］使用吉非替尼治療NSCLC，整體生存率和緩解率東方人群明顯優(yōu)于西方人群，且吉非替尼對以往化療失敗的局部晚期或轉移性NSCLC患者療效和安全性較好。有文獻［15－16］報道在NSCLC的EGFR-激酶域突變是激活突變，導致一個基本激活受體，如19外顯子的核苷酸2 481到2 495或2 482到2 496位的缺失，外顯子21密碼子858處的點突變與特異性EGFRTKI的反應有關系，靶向藥物吉非替尼和厄洛替尼有明顯療效。另外有研究報道［17］在NSCLC患者中一個異常的EGFR無義突變，臨床上反映聯(lián)合化療藥物厄洛替尼的敏感性低。Lynch 等［18］和 Gazdar等［19］分別報道酪氨酸激酶抑制劑對EGFR發(fā)生激活突變的患者療效明顯，且女性、腺癌患者、非吸煙者、亞洲人更容易發(fā)生EGFR激活突變。欒煥玲等［20］隨機調查了25例服用吉非替尼的患者(Ⅲ期患者5例，其余20例皆為Ⅳ 期，隨訪時間2009年3月～11月30日)，其中15例患者檢測出攜帶EGFR突變，12例患者中8例EGFR蛋白表達陰性，4例蛋白陽性病例(其中3例突變發(fā)生在19號外顯子)，總有效率達到80%;10例未發(fā)現(xiàn)EGFR突變的患者為2例，有效率占20%，經比較兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。東方人群的研究顯示EGFR突變是一個預測因子因為有利的臨床結果，而來自南美和歐洲的研究報道［3，21－29］在 EGFR 突變影響結果和給予 EGFR-TKI治療的患者臨床結果擴增方面存在爭議。

綜上所述，NSCLC中EGFR突變可以作為EGFR-TKI治療敏感性的預測因子，可以通過檢測EGFR突變的情況來指導臨床用藥和針對性個體化治療。所以，為了合理有效的運用靶向藥物，如何選擇對EGFR相關靶向藥物治療敏感的患者至關重要。

4 EGFR基因突變的檢測

研究結果證實EGFR基因突變與臨床病理特征的有一定關系，且深入進行相關靶向治療的研究，都是以檢測EGFR基因突變?yōu)榛A的。目前臨床實踐中，EGFR基因突變要在各種臨床樣本中檢測，這些樣本包括切除的組織、活組織和胸腔積液中。因此，尋找一種靈敏度高、簡單易操作、安全可靠的基因突變檢測方法是非常必要的?；蛲蛔儥z測方法主要是DNA測序、探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)、聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、突變體富集PCR(mutant-enriched PCR)、毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法(CE-LIF)。

DNA測序法［30］是檢測EGFR基因突變標準可靠的、應用最多的方法。該方法首先對樣品進行PCR擴增然后對擴增產品純化，最后進行序列分析，操作過程步驟繁瑣、時間較長，且對操作技術的要求較高，重要的是由于其方法本身的靈敏度低，僅能檢測含量大于30%的突變基因。從環(huán)境經濟方面考慮，此方法在臨床應用中存在局限性，不適合大量臨床樣品分析。

探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)又稱等位基因特異PCR，是將ARMS和Scorpions技術相結合的一種新技術。目前已有檢測EGFR突變的試劑盒，由英國的Delivering Pharmacogenomics公司推出。張靜等［13］應用此試劑盒對EGFR的18～21外顯子進行檢測，檢測結束后定量PCR儀以擴增曲線的形式輸出結果，根據DxS EGFR檢測試劑盒使用說明書判讀原則進行突變結果判讀，170例NSCLC標本EGFR突變的總檢出率為49.4%(84/170)。Kimura 等［31－32］分別采用 Scorpions ARMS 和測序法檢測了患者血清中EGFR的兩個熱點突變情況，結果表明Scorpions ARMS的檢出率明顯高于測序法(分別是48%和38%)。但該方法僅為少數研究機構應用，尚未批準進入臨床。

聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)與直接測序法相比，該法靈敏度高，可以發(fā)現(xiàn)測序未能發(fā)現(xiàn)的基因突變，然而也有其局限性:耗時長、操作復雜，不能定量只能定性分析。

突變體富集PCR(mutant-enriched PCR)既是PCR-酶切法，與直接測序法比較，敏感性較高，因為經過兩次PCR擴增，EGFR激活突變(包括外顯子19缺失和外顯子21點突變)的檢測率高、特異性強，可從103～104個野生型拷貝中檢測到一個EGFR突變基因［33］。但只能對已知的突變位點設計特異性引物進行測序，因此有一定的局限性。

對上述方法進行分析比較，發(fā)現(xiàn)DNA測序法是目前檢測基因突變的可靠標準。一項研究表明:通過EGFR基因拷貝數擴增預測EGFR-TKI療效的原因在于實驗所選擇患者中包含了大量的EGFR突變患者。EGFR突變是主要原因，而EGFR基因拷貝數擴增是關聯(lián)因素，進行EGFR-TKI療效預測可通過檢測EGFR突變?yōu)橹鳎?4］。因此，目前尋找一種快速準確的EGFR基因突變檢測方法是亟需解決的問題。陳巧云等［35］采用 CE-RFLP方法快速、高效地完成了胃癌p53基因248位、249位密碼子突變情況的同時檢測。劉圓圓等［36］還將此方法應用于臨床59例胃癌患者腫瘤組織H-ras基因12位密碼子點突變情況的檢測，獲得了較好的效果。因此，對于EGFR基因突變也可以采用高效毛細管電泳方法來檢測。EGRF基因突變的檢測對早期診斷、篩查EGFR-TKI敏感人群、預后治療、延長生存期、避免不必要的毒副作用及防止腫瘤多重耐藥性的發(fā)生等有無可替代的意義。

5 結語和展望

表皮生長因子受體(EGFR)屬于酪氨酸激酶I型受體家族成員，在大多數非小細胞癌(NSCLC)中表達上調，是治療NSCLC的一個重要靶點。EGFR基因突變與臨床病理特征相關，不同的人群，EGFR基因突變及突變率不同，靶向治療前針對患者的病理特征進行分析有助于指導臨床醫(yī)生用藥。靶向藥物因特異性強、毒性低成為目前臨床靶向治療用藥的一個研究熱點。EGFR基因突變在NSCLC中較常見，且與EGFR的特異性分子靶向藥物的治療效果密切相關。已有研究證實EGFR基因突變檢測與NSCLC靶向治療相關，使用EGFR-TKI前應檢測EGFR突變。所以尋找一種快速準確能應用于臨床大量樣本檢測的EGFR基因突變檢測方法是當務之急。通過檢測相關突變基因來指導臨床用藥同時為不具備基因靶點病人節(jié)省費用和毒副作用，減少了患者經濟、心理負擔，將會是分子靶向治療的一個熱點及發(fā)展趨勢。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.CA:a cancer journal of clinicians［J］.Cancer Stat，2007，57(1):43－66.

［2］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2006 ［J］.CA Cancer J Clin，2006，56:106－130

［3］Tokumo M，Toyooka S，Kiura K，et al.The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers［J］.Clin Cancer Res，2005，11:1167－73.

［4］Mitsudomi T，Kosaka T，Endoh H，et al.Mutation the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small cell lung cancer with postoperative recurrence［J］.Clin Oncol，2005，23:2513－20.

［5］韓 雪，戴廣海.胃癌中EGFR相關研究及意義［J］.臨床腫瘤學雜志，2010，15(2):173－6.

［5］Han X，Dai G H.Research on EGFR in gastric cancer and its significance［J］.Chin Clin Oncol，2010，15(2):173－6.

［6］Cao C，Lu S，Sowa A，et al.Priming with EGFR tyrosine kinase inhibitor and EGF sensitizes ovarian cancer cells to respond to chemotherapeutical drugs［J］.Cancer Lett，2008，266(2):249－62.

［7］Sharma S V，Bell D W，Settleman J，et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer［J］.Nat Rev Cancer，2007，7(3):169－81.

［8］Fukui T，Mitsudomi T.Mutations in the epidermal growth fact or receptor gene and effects of EGFR tyrosine kinase inhibitors on lung cancers［J］.Gen Thorae Cardiovasc Surg，2008，56(3):97－103.

［9］劉紅梅.表皮生長因子受體基因突變與晚期非小細胞肺癌的分子靶向治療［J］.南方醫(yī)科大學學報，2009，29(11):2273－5.

［9］Liu H M.Epidermal growth factor receptor gene mutations with advanced non-small cell lung cancer molecular targeted therapy［J］.J Southern Med Univ，2009，29(11):2273－5.

［10］Scag liotti G V，Selvagg I G，Novello S，et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10:4227－32.

［11］Paez J G，Janne P A，Lee J C，et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefltinib therapy［J］.Cancer，2004，304(5676):1497－500.

［12］Toyooka S，Soh J，Shigematsu H，et al.The impact and role of EGFR gene mutation non-small cell lung cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2006:58(1):25－31.

［13］張 靜，梁智勇，高 潔，等.非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因及k-ras基因突變與臨床病理特征的關系［J］.協(xié)和醫(yī)學雜志，2010，1(1):53－9.

［13］Zhang J，Liang Z Y，Gao J，et al.Relationship between the mutations of epidermal growth factor receptor gene and k-ras Gene and the clinicopathological features of non-small cell lung cancers［J］.Med J Peking Union Med Coll Hosp，2010，1(1):53－9.

［14］Sanford M，Scott L J.Gefitinib:a review of its use in the treatment of locaHy advanced/metastatic non-small cell lung cancer［J］.Drugs，2009，69:2303－28.

［15］Sharna S V，Bell D W，Settleman J，et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer［J］.Nat Rev Cancer，2007，7:169－81.

［16］Irmer D，F(xiàn)unk J O，Blaukat A .EGFR kinase domain mutationsfuctional impact and releva16-18 Human Chromosomes for lung cancer therapy［J］.Oncogene，2007，26:5693－701.

［17］González Manzano R，Martínez Navarro E，Eugenieva E，et al.A novel EGFR nonsense mutation in a non-small-cell lung cancer(NSCLC)patient who did not derive any clinical benefit with combination chemotherapy and erlotinib［J］.Clin Transl Oncol，2008，10:442－4.

［18］Lynch T J，Bell D W，Sordella R，et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor under lying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib［J］.NEJM，2004，350(21):2129－39.

［19］Gazdar A F.Activating and resistance mutations of EGFR18 Chang’non-small-cell lung cancer:role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors［J］.Oncogene，2009，28:S24－S31.

［20］欒煥玲，孫蕾娜，董 娜，等.非小細胞肺癌中EGFR和K-ras基因突變與蛋白表達相關的研究［J］.中國癌癥雜志，2010，20(7):486－91.

［20］Luan H L，Sun L N，Dong N，et al.Study of the correlation of EGFR and K-ras gene mutations with its protein expression in nonsmall cell lung cancer［J］.China Oncol，2010，20(7):486－91.

［21］Bell D W，Lynch T J，Haserlat S M，et al.Epidermal growth factor receptor mutations and gene amplification in non-small-cell lung cancer:molecular analysis of the IDEAL/INTACT gefitinib trials［J］.Clin Oncol，2005，23:8081－92.

［22］Cappuzzo F，Hirsch F R，Rossi E，et al.Epidermal growth factor receptor gene and proteinand gefiinib sensitivity in non-small-cell lung cancer［J］.Natl Cancer Inst，2005，97:643－55.

［23］Chou T Y，Chiu C H，Li L H，et al.Mutation in the tyrosine kinase domain of epidermal growth factor receptor is a predictive and prognostic factor for gefitinib treatment in patients with non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11:3750－7.

［24］Han S W，Kim T Y，Hwang P G，et al.Predictive and prognostic impact of epidermal growth factor receptor mutation in non-small cell lung cancer patients treated with gefitinib［J］.Clin Oncol，2005，23:2493－501.

［25］Mitsudomi T，Kosaka T，Endoh H，et al.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence［J］.Clin Oncol，2005，23:2513－20.

［26］Riely G J，Pao W，Pham D，et al.Clinical course of patients with non-small cell lung cancer and epidermal growth factor receptor exon 19 and exon 21 mutation streated with gefitinib or erlotinib［J］.Clin Cancer Res，2006，12(31):839.

［27］Shih J Y，Gow C H，Yang P C.EGFR mutation conferring primary resistance to gefitinib in non-small-cell lung cancer［N］.Engl J Med，2005，353:207－8.

［28］Takano T，Ohe Y，Sakamoto H，et al.Epidermal growth factor receptor gene mutations and increased copy numbers predict gefitinib sensitivity in patients with recurrent non-small-cell lung cancer［J］.Clin Oncol，2005，23:6829－37.

［29］Tsao M S，Sakurada A，Cutz J C，et al.Erlotinib in lung cancermolecular and clinical predictors of outcome［N］.Engl J Med，2005，353:133－44.

［30］Fan X，F(xiàn)urnari F B，Cavenee W K，et al.Non-isotop silver-stained SSCP is more sensitive than automated direct sequencing for the detection of PTEN mutations in a mixture of DNA extracted from normal and tumor cells［J］.Int J Oncol，2001，18(5):1023－6.

［31］Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as apredictor of the response to gefitinib in patients with non-small cell lung cancer［J］.Cancer Res，2006，12(13):3915－21.

［32］Kimura H，Suminoe M，Kasahara K，et al.Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serum DNA as a predictor of response to gefitinib(IRESSA)［J］.Br J Cancer，2007，97(6):778－84.

［33］Asano H，Toyooka S，Tokumo M，et al.Detection of EGFR gene mutation in lung cancer by mutant-enriched polymer as chain reaction assay［J］.Clin Cancer Res，2006，12(1):43－8.

［34］郭愛林.IPASS臨床研究公布不同EGFR分子標記物改變對臨床療效的影響［J］.循證醫(yī)學，2009，9(4):200.

［34］Guo A L.IPASS clinical study published the different EGFR molecular markers change clinical efficacy［J］.J Evidence-Based Med，2009，9(4):200.

［35］陳巧云，王 榮，賈正平 等.毛細管電泳-限制性片段長度多態(tài)性快速檢測胃癌組織中p53基因點突變的方法［J］.分析化學，2007，9:1305－8.

［35］Chen Q Y，Wang R，Jia Z P，et al.Fast detection of p53 gene mutation of gastric cancer by restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis［J］.Chin J Analyt Chem，2007，35(9):1305－8.

［36］劉圓圓，王 榮，賈正平，等.毛細管電泳-限制性片段長度多態(tài)性分析檢測胃癌H-ras基因點突變［J］.化學學報，2009，67(4):323－8.

［36］Liu Y Y，Wang R，Jia Z P，et al.H-ras gene mutation detection of gastric cancer by restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis［J］.Acta Chim Sin，2009，67(4):323－8.