HIV-1整合酶抑制劑體外篩選方法研究進(jìn)展

張 旋，楊柳萌，鄭永唐

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所中國(guó)科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223;2.昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650031;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

目前，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)30多種抗HIV藥物用于臨床，可組成20多種高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)。盡管HAART療法明顯降低了AIDS/HIV患者的死亡率，但依然存在耐藥、服藥繁瑣、依從性差、費(fèi)用高、無(wú)法徹底清除病毒和毒副作用等問(wèn)題［1－2］。因此，尋找具有新作用靶點(diǎn)的新一代抗HIV藥物非常必要。

整合酶(Integrase，IN)是HIV-1復(fù)制所必需的酶，而且宿主細(xì)胞內(nèi)不存在該酶類似物，因此，已成為抗HIV-1藥物的理想靶點(diǎn)［3－4］。近年來(lái)，關(guān)于整合酶抑制劑的研究報(bào)道層出不窮，但迄今為止，Raltegravir仍是唯一上市的HIV整合酶抑制劑。因而，發(fā)現(xiàn)新一代整合酶抑制劑具有重要意義。高通量、高靈敏、簡(jiǎn)單易行的篩選方法是發(fā)現(xiàn)新一代整合酶抑制劑的前提。目前報(bào)道的整合酶抑制劑篩選方法已經(jīng)有多種，各有優(yōu)缺點(diǎn)，該文將對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的這些方法及最新進(jìn)展做一介紹。

1 HIV-1整合酶結(jié)構(gòu)與功能

整合酶是由HIV-1 pol基因編碼的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量32 ku，由288個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，可分為3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域(NTD:1～50)、催化核心結(jié)構(gòu)域(CCD:51～212)和C端結(jié)構(gòu)域(CTD:213～288)。CCD包含酶的活性中心，具有催化活性［5］。2010年，整合酶的三維晶體結(jié)構(gòu)被成功解析［6］，有助于研發(fā)出更高效、特異和低毒的新一代整合酶抑制劑。在HIV-1復(fù)制過(guò)程中，整合酶的功能是將病毒DNA整合到宿主細(xì)胞染色體中，這一過(guò)程主要由整合酶的3'端加工和鏈轉(zhuǎn)移活性來(lái)完成［5］。在體外，二聚體形式的整合酶就具有3'端加工活性，而只有四聚體形式的整合酶才具備鏈轉(zhuǎn)移活性［7］。

2 設(shè)計(jì)整合酶抑制劑的作用靶點(diǎn)

根據(jù)整合酶的結(jié)構(gòu)與功能，應(yīng)從以下靶點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)整合酶抑制劑:① 抑制3'端加工活性;② 抑制鏈轉(zhuǎn)移活性;③ 抑制IN核定位;④抑制IN多聚體形成;⑤ 抑制IN與DNA的結(jié)合;⑥抑制IN與宿主細(xì)胞因子結(jié)合。

Fig 1 Principle of TRFIA for HIV-1 integrase 3'-processing activity［13］

3 HIV-1整合酶抑制劑篩選方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是以微孔板為基礎(chǔ)的一種高通量篩選方法，近年來(lái)被廣泛用于HIV-1整合酶抑制劑篩選。此法通常采用磷酸化DNA底物或親和素－生物素體系標(biāo)記的DNA底物包被微孔板，應(yīng)用酶(HRP或AKP)標(biāo)記的二抗，加入酶底物或化學(xué)發(fā)光底物來(lái)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物［8－10］。ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、無(wú)放射性污染和高通量，缺點(diǎn)是微孔板需要特殊預(yù)處理，DNA底物需要標(biāo)記，封閉易造成非特異性吸附和背景信號(hào)干擾，只能檢測(cè)整合酶總活性或者鏈轉(zhuǎn)移活性，不能單獨(dú)檢測(cè)3'端加工活性。何紅秋等［11］采用的熒光方法檢測(cè)整合酶鏈轉(zhuǎn)移活性是一種改良的ELISA方法，其改良之處在于采用了熒光素FITC標(biāo)記的二抗，直接用熒光酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)，提高了檢測(cè)靈敏度。何紅秋等［12］還對(duì)ELISA方法進(jìn)行了另一種改良，采用鏈親和素標(biāo)記的磁珠來(lái)捕獲生物素標(biāo)記的整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物，該法節(jié)省了對(duì)微孔板包被的步驟，節(jié)省了時(shí)間，提高了檢測(cè)特異性。

3.2 時(shí)間分辨熒光法 時(shí)間分辨熒光法(time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種以稀土元素(多用Eu)為標(biāo)記、用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光的非同位素免疫分析技術(shù)。TRFIA檢測(cè)整合酶3'端加工抑制劑的原理是，合成一段HIV-1 LTR的U5端DNA序列，在其3'端標(biāo)記生物素，然后將其包被在微孔板中，加入待測(cè)化合物孵育，再加入整合酶進(jìn)行3'端加工反應(yīng)后，通過(guò)洗滌去除剪切的生物素標(biāo)記的核苷酸，然后加入親和素偶聯(lián)的Eu(SA-Eu)，SA-Eu可結(jié)合未剪切的生物素標(biāo)記的底物序列，通過(guò)時(shí)間分辨熒光計(jì)檢測(cè)熒光信號(hào)(Fig 1)［13－15］。從某種程度上講，TRFIA即是一種改良的ELISA方法，也是一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法。TRFIA同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，與傳統(tǒng)ELISA比較，大大提高靈敏度和穩(wěn)定性，不足之處是成本相對(duì)較高。

3.3 AlphaScreen AlphaScreen，也稱為納米均相時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，其利用作為供體和受體的水凝膠微珠來(lái)檢測(cè)生物分子的相互作用。AlphaScreen目前已被用于篩選整合酶二聚體抑制劑、整合酶與宿主細(xì)胞因子(Importin和LEDGF/p75)相互作用抑制劑［16－20］。以整合酶二聚體抑制劑篩選為例，將GST-IN和His-IN單聚體和Ni2+-受體微珠(用來(lái)結(jié)合His-IN)、待測(cè)化合物和glutathione-供體微珠(用來(lái)結(jié)合GST-IN)一起孵育，在680 nm激光照射下，供體微珠上的光敏劑受激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，當(dāng)GST-IN和His-IN形成二聚體時(shí)，單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微珠，進(jìn)一步激活了同樣在受體微珠上的熒光基團(tuán)，使之發(fā)出熒光，波長(zhǎng)為520～620 nm，當(dāng)化合物有抑制作用時(shí)，GST-IN和His-IN不能形成二聚體，單線態(tài)氧無(wú)法擴(kuò)散至受體，不會(huì)有熒光信號(hào)產(chǎn)生(Fig 2)。AlphaScreen的優(yōu)點(diǎn)是高通量、無(wú)需包被和洗板、耗時(shí)短、靈敏度高，不足之處是成本相對(duì)較高。

Fig 2 Principle of HIV-1 integrase dimerization AlphaScreen assay［16］

3.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是近年來(lái)應(yīng)用的一種新的HIV-1整合酶抑制劑篩選方法［15，21］。該方法是將2個(gè)熒光基團(tuán)分別偶聯(lián)在DNA兩端(3'端加工:偶聯(lián)在供體DNA兩端;鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng):分別偶聯(lián)在供體DNA和靶DNA末端)，當(dāng)2個(gè)熒光基團(tuán)距離合適時(shí)，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，如受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生熒光猝滅;如受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體熒光。有研究采用的分子信標(biāo)方法檢測(cè)整合酶3'端加工反應(yīng)的原理實(shí)質(zhì)上也是熒光共振能量轉(zhuǎn)移［11－22］。FRET為液相反應(yīng)，能夠更好的模擬體內(nèi)反應(yīng)環(huán)境，能分別檢測(cè)各步反應(yīng);不需要包被和封閉微孔板，減少了一些耗時(shí)耗力的操作;使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)，靈敏度較高，而且可以高通量篩選。此方法的不足在于需要熒光酶標(biāo)儀，不易普及。

3.5 細(xì)胞水平整合酶抑制劑篩選方法 2011年，Van等［23］設(shè)計(jì)出一種細(xì)胞水平高通量整合酶抑制劑篩選方法。該方法利用有熒光素酶報(bào)告基因的假病毒感染MT-4細(xì)胞，隨后用RT抑制劑奈韋拉平使假病毒復(fù)制同步后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4.5 h，使逆轉(zhuǎn)錄完成，然后將細(xì)胞和待測(cè)化合物加入微孔板，孵育過(guò)夜(±20 h)，感染細(xì)胞可表達(dá)熒光素酶，加入熒光素酶底物，熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。該方法優(yōu)點(diǎn)是高通量、高靈敏度、無(wú)需合成供體和靶DNA，缺點(diǎn)是不能直接檢測(cè)化合物對(duì)整合酶活性的影響，而只是檢測(cè)化合物作用在整合階段。細(xì)胞水平假病毒模型篩選也可通過(guò)MAGI檢測(cè)法來(lái)實(shí)現(xiàn)，即采用可誘導(dǎo)表達(dá)MAGI的TZM-b1細(xì)胞或MAGI-5細(xì)胞，在感染HIV后，細(xì)胞內(nèi)整合的HIV LTR β-gal報(bào)告基因表達(dá)，感染細(xì)胞染成藍(lán)色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即可判斷HIV感染情況［24－25］。該方法比較經(jīng)濟(jì)，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量，而且人工計(jì)數(shù)存在主觀性。細(xì)胞水平篩選還可應(yīng)用野生型HIV-1，根據(jù)HIV在細(xì)胞中的復(fù)制周期，采用分時(shí)加藥的方法進(jìn)行，并選擇相應(yīng)的進(jìn)入抑制劑、RT抑制劑和整合酶抑制劑作為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變或ELISA檢測(cè)p24，可以大致判斷待測(cè)藥物是否作用在整合階段［26－27］。該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法精確判定藥物是否直接抑制整合酶活性。

整合酶必需進(jìn)入細(xì)胞核才能完成整合功能，因此抑制整合酶的細(xì)胞核定位可有效抑制HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［28－29］。整合酶核定位抑制劑的篩選也是基于細(xì)胞水平的熒光顯微鏡方法［28，30－31］。原理是將熒光蛋白與整合酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞或HeLa細(xì)胞，然后加入待測(cè)化合物，熒光顯微鏡下觀察整合酶在細(xì)胞內(nèi)分布情況。如果化合物有抑制作用，則熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以高通量，缺點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果僅僅是定性判斷。

3.6 其他方法 除上述方法外，整合酶抑制劑篩選尚有放射自顯影法［32］、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法［33－35］、表面等離子共振(SPR)［36］等方法。放射自顯影法應(yīng)用最早，但需要進(jìn)行凝膠電泳，耗時(shí)耗力，無(wú)法高通量，且放射性元素污染環(huán)境，故現(xiàn)已少用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法雖然精確度和靈敏度高，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量，且成本較高。SPR雖然可以高通量篩選，但成本較高、需要特殊Biacore檢測(cè)儀器，故也不能普及。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，整合酶抑制劑也可借助借助計(jì)算機(jī)技術(shù)和專業(yè)軟件進(jìn)行虛擬篩選，主要針對(duì)整合酶的三維結(jié)構(gòu)或已知抑制劑的藥效團(tuán)，從化合物數(shù)據(jù)庫(kù)篩選整合酶抑制劑［37－40］。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)篩選相比，虛擬篩選優(yōu)勢(shì)在于高效、快速、經(jīng)濟(jì)，但缺乏完善有效的評(píng)估體系，未考慮藥物復(fù)雜的作用機(jī)制及體內(nèi)毒性等問(wèn)題。將實(shí)驗(yàn)篩選方法和虛擬篩選結(jié)合是今后藥物篩選的方向，有望研發(fā)出新一代強(qiáng)效、特異的HIV整合酶抑制劑。

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