重組人NAMPT蛋白靜脈注射對(duì)正常小鼠生理生化指標(biāo)及腦結(jié)構(gòu)的影響

袁綺藝，張緯萍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，浙江杭州 310058）

尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是哺乳動(dòng)物煙酰胺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)補(bǔ)救合成途徑的限速酶［1］，NAMPT又被稱為前 B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(pre-B-cell-colony-enhancing factor，PBEF)，因?yàn)槠淠軌虼龠M(jìn)前 B細(xì)胞的成熟［2］，同時(shí)NAMPT又是一種較新的脂肪因子，被稱為visfatin［3］。

被釋放至細(xì)胞外的NAMPT統(tǒng)稱為細(xì)胞外NAMPT(eNAMPT)，部分可以進(jìn)入血液循環(huán)。細(xì)胞外NAMPT除了具有催化作用外，還具有類似細(xì)胞因子的非酶作用［4-5］，介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)［6-7］。近年來，大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗等代謝性疾病患者的血 NAMPT水平增高，提示NAMPT與這些疾病密切相關(guān)［8-9］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NAMPT可能通過增加胰島素的釋放和增加胰島素的敏感性，從而降低血糖水平［3，10］。NAMPT亦能通過增加葡萄糖的代謝來降低血糖水平，可促進(jìn)血葡萄糖轉(zhuǎn)化為三酰甘油，促進(jìn)三酰甘油在前脂肪細(xì)胞的積聚［3］。同時(shí)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NAMPT在降低血糖的同時(shí)可導(dǎo)致腹部脂肪沉積，這可能是肥胖發(fā)生的原因之一［11］。而在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織可以合成和分泌包括NAMPT在內(nèi)的多種促炎性因子作用于胰島素敏感器官，參與胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展過程，并增加肥胖患者心血管疾病的發(fā)生率［12］。因此，一些研究者認(rèn)為血NAMPT水平增高可能是這些疾病的生物標(biāo)記物，然而血NAMPT增高是否能夠?qū)е卵?、血脂代謝的異常尚未見報(bào)道。

血NAMPT水平還與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如腦膠質(zhì)瘤、腦缺血患者的血NAMPT水平顯著增加［13-14］。最近發(fā)現(xiàn)，老年小鼠血清NAMPT表達(dá)顯著增加［15］，而且增加水平與小鼠的活動(dòng)量成負(fù)相關(guān);再者，小鼠腦內(nèi)注射NAMPT可引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但激活作用與NAMPT的催化作用無關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)注射重組NAMPT蛋白可影響大鼠和雞的攝食量和體重［15-16］。然而，血清NAMPT長(zhǎng)期增高是否對(duì)正常小鼠腦結(jié)構(gòu)有影響，目前尚不清楚。

總之，血NAMPT的水平與代謝性疾病、部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，血NAMPT在這些疾病發(fā)生發(fā)展中的作用是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)——包括研究是否能夠作為一些疾病的生物標(biāo)記物，血NAMPT與這些疾病發(fā)生的因果關(guān)系如何，它是否是這些疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。因此，本研究通過多次尾靜脈注射重組人NAMPT蛋白，持續(xù)增加正常小鼠血清中NAMPT水平，觀察對(duì)多種生理/生化指標(biāo)及神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響;為鑒別NAMPT的作用與其催化有關(guān)，或者是與其非酶作用有關(guān)，同時(shí)采用了酶活性缺乏的重組人NAMPT/H247A蛋白，從而評(píng)價(jià)血 NAMPT是否有獨(dú)立的致病風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Balb/c成年健康雄性小鼠，體重25～30 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。實(shí)驗(yàn)遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境(22℃ ±1℃)下，保持12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

1.2 主要儀器 冰凍切片機(jī)(CM1900，德國(guó)Leica);普通倒置熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus);低溫超速離心機(jī)(HIMAC CR22型，日立公司);SDS-PAGE膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)BIO-RAD公司);大小鼠智能無創(chuàng)血壓計(jì)(BP-98A，日本軟隆株式會(huì)社);全自動(dòng)血液生化儀(Cobas C311，美國(guó)羅氏)。

1.3 試劑 鼠抗 NeuN抗體、鼠抗 GFAP抗體、Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司;兔抗Iba1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;封閉用羊血清購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;含DAPI的ProLong Gold Antifade購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;其余為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 重組人NAMPT蛋白制備及注射 重組人NAMPT野生型蛋白及酶活性缺失的重組人NAMPT/H2471突變蛋白經(jīng)BL21細(xì)菌表達(dá)，鎳柱純化。重組蛋白每3天進(jìn)行1次尾靜脈注射，注射劑量分別為 10、30、100μg/kg，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行32 d。每3天測(cè)量小鼠體重。

1.5 血壓和心率的測(cè)量 采用大小鼠智能無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量小鼠血壓和心率。以小鼠固定器限制小鼠的活動(dòng)，將血壓測(cè)量器壓套套至小鼠尾部近心端處，傳感器置于尾中上1/3處，傳感器表面對(duì)準(zhǔn)鼠尾腹面并固定，記錄心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。每只動(dòng)物重復(fù)測(cè)3次，取平均值。

1.6 血液生化指標(biāo)的測(cè)量 用摘眼球法采取小鼠血樣0.8～1.0 ml。血樣在室溫下靜置40 min，以3000 r/min低溫離心10 min，取上清。采用葡萄糖氧化酶法、甘油三酯比色法和膽固醇重氮法測(cè)量血糖、總膽固醇及甘油三酯。

1.7 腦組織免疫熒光染色 小鼠麻醉后經(jīng)心臟先后灌流固定，取腦后用4%多聚甲醛后固定24 h，以30%蔗糖脫水，冰凍切片厚度為30 μm，以漂片法進(jìn)行免疫熒光染色。將腦片置于PBS漂洗，以10%羊血清封閉30 min后，加入鼠抗NeuN抗體(1∶200)或鼠抗GFAP抗體(1∶1000)或兔抗 Iba1抗體(1∶600)，4℃孵育過夜。PBS漂洗后，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(1∶200)或Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(1∶200)，室溫孵育2 h，以 PBS漂洗后，將腦片貼至玻片，避光干燥，以含 DAPI的ProLong Gold Antifade封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 甲苯胺藍(lán)染色 30 μm厚腦片置于1%甲苯胺藍(lán)溶液染色2 min，自來水沖洗，分別用0.5%鹽酸/75%乙醇溶液分化，95%乙醇脫水2 min，無水乙醇脫水2 min，吹干后浸入二甲苯透明5 min，重復(fù)3次，用中性樹膠封片。腦片在光鏡下拍照分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Prism 5軟件作One-way-ANOVA檢驗(yàn)差異顯著性。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靜脈注射重組NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠體重的影響 在注射野生型和突變型NAMPT的1～32 d間，2種NAMPT蛋白不同劑量注射對(duì)小鼠體重均無明顯影響(圖1)。

圖1 重組NAMPT蛋白多次靜脈注射對(duì)正常小鼠體重增加的影響Fig.1 Effect of NAMPT or NAMPT/H247A intravenous multiple injection on body weight gain of normal mice

2.2 靜脈注射重組NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠血糖和血脂的影響 實(shí)驗(yàn)小鼠在32 d后，取血檢測(cè)血糖、血總膽固醇及血甘油三酯，發(fā)現(xiàn)野生型NAMPT和H247A突變型NAMPT蛋白對(duì)這三項(xiàng)血液生化指標(biāo)均無明顯影響(圖2A、B和C)。

2.3 靜脈注射重組NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠血壓及心率的影響 實(shí)驗(yàn)小鼠在32 d后，采用無創(chuàng)檢測(cè)方法對(duì)小鼠的血壓和心率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)WT NAMPT和H247A NAMPT對(duì)小鼠的心率、平均動(dòng)脈壓、收縮壓及舒張壓均無明顯影響(圖3A、B、C 和 D)。

圖2 重組NAMPT蛋白多次靜脈注射對(duì)正常小鼠血糖(A)、血總膽固醇(B)和血甘油三酯(C)的影響Fig.2 Effect of NAMPT orNAMPT/H247A intravenous multiple injection on blood glucose(A)，total cholesterol(B)and triglycerides(C)of normal mice

2.4 靜脈注射重組NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠CA1區(qū)神經(jīng)元的影響 實(shí)驗(yàn)在32 d后，以Nissel染色和NeuN免疫組化染色檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)野生型NAMPT和H247A突變型NAMPT蛋白多次靜脈注射對(duì)神經(jīng)元的形態(tài)無明顯影響(圖4)。

2.5 靜脈注射重組NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響 實(shí)驗(yàn)在32 d后，以GFAP免疫組化染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞，以Iba1免疫組化染色觀察小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2種NAMPT對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞均無明顯的激活作用，未見星形膠質(zhì)細(xì)胞的腫大(圖5A)，亦未見有圓形的、被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞(圖5B)。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加血NAMPT水平，對(duì)正常小鼠體重、血壓、心率、血糖、總膽固醇、甘油三酯等均無明顯影響，對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也無明顯影響。抑制 NAMPT的催化作用，但保留其非酶作用——即采用 NAMPT/H247A突變蛋白，與NAMPT野生型蛋白的作用相同。

首先，本研究結(jié)果顯示，靜脈注射野生型或H247A突變型NAMPT蛋白不影響正常小鼠的血糖。2005年Fukuhara等在《Science》發(fā)表論文指出，NAMPT具有降血糖作用，而且其作用方式是通過作用在胰島素受體實(shí)現(xiàn)，并指出胰島素受體是NAMPT的作用靶點(diǎn)［3］。然而2年后，由于證據(jù)不充分，結(jié)果不能完全被重復(fù)，該論文被迫撤銷，從而導(dǎo)致了對(duì)NAMPT是否作用于胰島素的爭(zhēng)議。近年研究認(rèn)為，NAMPT可能是機(jī)體保持血糖平衡的反饋調(diào)節(jié)因子之一，NAMPT可通過增加胰島β細(xì)胞釋放胰島素［3，10］，或者增加胰島素的敏感性［17］，通過促進(jìn)血漿葡萄糖轉(zhuǎn)化為三酰甘油［3］，從而降低血糖水平。然而也有一些不同的報(bào)道否認(rèn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胰島β細(xì)胞中血NAMPT對(duì)胰島素受體的作用［18-21］。另有學(xué)者認(rèn)為，代謝綜合征中NAMPT應(yīng)該被看做一種促進(jìn)胰島素抵抗發(fā)展的前炎癥因子［22］;NAMPT在II型糖尿病中的增加與肥胖和胰島素抵抗無關(guān)［23-25］。在本研究中，由于正常小鼠本身能夠分泌足夠的胰島素，同時(shí)其胰島素受體的敏感性正常，這可能是NAMPT對(duì)正常血糖不影響的原因。

圖5 重組NAMPT蛋白多次靜脈注射對(duì)正常小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞(A)及小膠質(zhì)細(xì)胞(B)的影響Fig.5 Effect of NAMPT or NAMPT/H247A intravenous multiple injection on astrocyte(A)and microglia(B)in hippocampus of normal mice

其次，多次靜脈注射野生型或H247A突變型NAMPT蛋白不影響正常小鼠的血脂水平。有文獻(xiàn)報(bào)道，NAMPT可以促進(jìn)三酰甘油在前脂肪細(xì)胞的積聚，并促進(jìn)脂肪組織的分化、合成和儲(chǔ)積［3］。在非糖尿病的白種人臨床病例中發(fā)現(xiàn)，血NAMPT水平與高密度脂蛋白呈正相關(guān)，與甘油三酯呈負(fù)相關(guān)，這種顯著的相關(guān)性可能與NAMPT具有的NAD合成酶作用存在著聯(lián)系［26］，因?yàn)橛醒芯繄?bào)道，煙酸在增加血清高密度脂蛋白的同時(shí)能夠減少血清中富含甘油三酯的脂蛋白［27］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組總膽固醇、甘油三酯略有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

多次靜脈注射野生型或H247A突變型NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠的血壓和心率也無明顯影響。NAMPT本身并沒有血管收縮或舒張作用，不參與對(duì)血管的張力調(diào)節(jié)，在年輕高血壓患者血NAMPT水平與對(duì)照組相近，NAMPT的失調(diào)可能與高血壓發(fā)病機(jī)制無關(guān)［28］。另外，NAMPT對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞正常狀態(tài)下影響不明顯，但在高糖環(huán)境中，NAMPT使內(nèi)皮細(xì)胞壽命增加，內(nèi)皮血管形成能力增強(qiáng)［29］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過尾靜脈注射增加血清NAMPT水平，對(duì)小鼠血壓、心率沒有明顯影響，這進(jìn)一步說明在正常小鼠，血NAMPT可能不參與血管功能的調(diào)節(jié)。

最后，經(jīng)多次靜脈注射野生型或H247A突變型NAMPT蛋白對(duì)正常小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞均無明顯的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，直接在側(cè)腦室注射重組NAMPT蛋白可引起大鼠攝食減少，體重減輕［15］，在雛雞腦室注射重組NAMPT蛋白則增加攝食量，但不影響飲水量［16］。而我們發(fā)現(xiàn)，在大鼠側(cè)腦室注射重組NAMPT蛋白，可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，在原代培養(yǎng)大鼠平層混合神經(jīng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，重組NAMPT蛋白也能激活小膠質(zhì)細(xì)胞(未發(fā)表資料)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血清NAMPT的增加未對(duì)中樞神經(jīng)功能或者神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響，主要可能是血NAMPT在正常小鼠不能通過血腦屏障。

總之，通過多次靜脈注射，較長(zhǎng)時(shí)間的增加正常小鼠血清中NAMPT或者NAMPT/H247A水平，對(duì)小鼠的生理生化指標(biāo)及腦內(nèi)主要神經(jīng)細(xì)胞均無明顯影響，提示血NAMPT的單獨(dú)增高在正常個(gè)體可能不會(huì)引起代謝性疾病和神經(jīng)功能障礙的發(fā)生，血NAMPT增高作為獨(dú)立致病因素的風(fēng)險(xiǎn)較低。但不能排除在有代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、老年等特殊病理生理?xiàng)l件下，血NAMPT增高后通過與其它分子產(chǎn)生相互作用，或者通過血腦屏障，從而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。

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