亞麻脫膠菌發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶的粗提

薛小華，丁若垚，郁崇文，張興群

(東華大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201620)

亞麻是人類最早使用的天然植物纖維，亞麻脫膠即亞麻粗紗煮煉，目的主要是去除部分黏結(jié)單纖維的膠質(zhì)，利于亞麻工藝?yán)w維進(jìn)一步分劈，進(jìn)而提高亞麻工藝?yán)w維的可紡性，但粗紗化學(xué)煮煉能耗高，形成的廢水對環(huán)境污染嚴(yán)重。相比傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠方法，亞麻生物脫膠是一種綠色環(huán)保的脫膠方法，它具有提高精干麻質(zhì)量，不損傷纖維，無污染等優(yōu)點(diǎn)。前文報(bào)道了脫膠細(xì)菌在亞麻粗紗煮煉中的初步應(yīng)用［1］，通過試驗(yàn)探討了假單胞菌DA10發(fā)酵液用量、初始pH值、煮煉溫度和處理時(shí)間對細(xì)菌煮煉的影響。通過假單胞菌DA10脫膠后亞麻纖維失重率、強(qiáng)度、細(xì)度參數(shù)的測定，表明經(jīng)DA10菌脫膠的亞麻，纖維損傷較小，保證了亞麻纖維品質(zhì)，符合紡紗的工藝要求，并達(dá)到了綠色環(huán)保的效果。在此基礎(chǔ)上試圖通過對亞麻快速生物脫膠菌株DA10發(fā)酵溫度、pH、發(fā)酵時(shí)間等條件進(jìn)行正交優(yōu)化，探明該菌株的快速生物脫膠發(fā)酵條件，并通過脫膠對其發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行驗(yàn)證，為尋求最佳的脫膠工藝參數(shù)，形成實(shí)用的“亞麻快速生物脫膠技術(shù)”奠定基礎(chǔ)。生物脫膠技術(shù)成本低，并已在亞麻［2］、苧麻［3］、大麻［4］等纖維的脫膠中使用。同時(shí)，脫膠菌所分泌的酶要比商業(yè)酶在成分上更全。針對于此，本研究通過鹽析分級沉淀的方法從亞麻脫膠菌DA10發(fā)酵液中粗提取亞麻脫膠酶，并測定相應(yīng)的酶活得到各個(gè)酶硫酸銨鹽析的飽和度范圍，進(jìn)行大量的脫膠酶鹽析沉淀，并與發(fā)酵液脫膠進(jìn)行對比，為亞麻脫膠酶進(jìn)行亞麻脫膠奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種:由實(shí)驗(yàn)室自行篩選得到的一株亞麻脫膠菌，即假單胞菌DA10。

原料:原麻來自湖北精華紡織集團(tuán)有限公司;亞麻粗紗來自浙江金鷹集團(tuán)有限公司。粗紗中纖維的性能:纖維線密度1.15 tex，束纖維強(qiáng)度33.90 cN/tex。

設(shè)備:智能控制恒溫?fù)u床 (ATS－051D/052D，上?？蚌蜟hemStar儀器設(shè)備有限公司)、手提式壓力蒸汽滅菌鍋 (YXQ SG41 280)、BOXUN超凈臺(tái) (潔凈等級:100，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、真空冷凍干燥機(jī) (上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)、高速冷凍離心機(jī) (日立Hitachi高速冷凍離心機(jī))、TF020型Sirolan－tensor束纖維強(qiáng)力儀 (澳大利亞SIROLAN公司)、Y171C型纖維切斷器、JN－B型精密扭力天平 (量程10 mg，分度值0.02 mg)等。

培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基為亞麻培養(yǎng)基K2HPO41g，MgSO40.5g，亞麻粉 5g，(NH4)2SO45g，KCl 0.5g，H2O 1000ml，pH 7.0 －7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活化菌種，制備種子液

將冷凍保藏在－20℃下的DA10菌種保藏液取出，在無菌條件下，接種到裝有200ml種子培養(yǎng)液 (牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液)的錐形瓶中。37℃、200r/min下培養(yǎng)12h。

1.2.2 發(fā)酵

將200ml種子培養(yǎng)液接種到2000ml原麻培養(yǎng)基中 (即擴(kuò)大10倍)，按照正交實(shí)驗(yàn)［5，6］設(shè)計(jì)方案即在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。由前期實(shí)驗(yàn)得出影響較大的因子是溫度、時(shí)間和初始pH，故對三個(gè)影響因子進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 酶活性測定

DNS法［7］測定發(fā)酵液中纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的活性。

1個(gè)酶活力單位定義為:酶反應(yīng)最適溫度下，每小時(shí)水解底物產(chǎn)生1mg單糖所需的酶量，以U/ml表示。即:

式中:U—酶活力單位 (U/ml);

G—酶解液中還原性醛基含量 (mg);

N—酶液稀釋倍數(shù);

V—加酶液量 (ml);

t—酶解時(shí)間 (h)。

1.2.4 硫酸銨鹽析

將發(fā)酵完畢的亞麻培養(yǎng)基發(fā)酵液均分至離心管中，8000rpm離心15min，棄去沉淀，將上清液收集至大燒杯中用20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%飽和度的硫酸銨逐級鹽析發(fā)酵液，對上清液進(jìn)行取樣測定相應(yīng)的果膠酶和木聚糖酶活，獲得果膠酶和木聚糖酶鹽析曲線。選擇最適鹽析范圍進(jìn)行大量鹽析，獲得大量酶。

1.2.5 冷凍干燥

將獲得的各種酶放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24小時(shí)，取出稱取相應(yīng)質(zhì)量。

1.2.6 纖維線密度測定

纖維線密度的測試方法為中段切斷稱重法。所切取纖維的長度為20 mm，所稱取纖維的質(zhì)量為7.5～8.3 mg(折算成公定質(zhì)量)。每個(gè)試樣測試3次取平均值作為測試結(jié)果。

1.2.7 束纖維強(qiáng)度測定

1.2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 因子水平表Tab.1 Factors and levels designed for fermentation

如表1，選擇3因子3水平正交試驗(yàn)方法對影響發(fā)酵的因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

1.2.8 掃描電鏡分析

本試驗(yàn)使用DXS－10A普及型智能化掃描電子顯微鏡進(jìn)行測試。加速電壓為2kV－30kV，最大放大倍數(shù)為50000倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交法對多因子發(fā)酵條件

2.1.1 發(fā)酵初始pH、發(fā)酵溫度、時(shí)間的正交試驗(yàn)

由極差分析法得出各個(gè)影響因子對亞麻脫膠菌DA10發(fā)酵的影響程度，極差R1的大小順序均為A ＞B＞C即影響纖維素酶因子的主次關(guān)系為:發(fā)酵時(shí)間＞溫度＞pH。R2，R3的大小順序均為B＞A＞C。即通過果膠酶活，木聚糖酶活皆表明:影響亞麻脫膠菌DA10發(fā)酵的諸因素的主次關(guān)系依次是pH＞溫度＞發(fā)酵時(shí)間。

圖1 不同水平下各因子對纖維素酶，果膠酶和木聚糖酶酶活的趨勢圖Fig.1 Curves of cellulase，pectinase and xylanase activities under different factors and levels

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental results

亞麻脫膠主要去除果膠和半纖維素，保留纖維素。依據(jù)酶的特異性，理論上纖維素酶活越小越好，果膠酶活和木聚糖酶活越大越好。故果膠酶的最優(yōu)條件是A2B3C1，木聚糖酶的最優(yōu)條件是A2B2C2。

從表4可以看出：采用本文自制的壓力環(huán)傳感器測試斜拉索的索力與采用加速度傳感器測試的索力吻合情況良好，隨著索力的增加，兩者之間的誤差也越來越小。這表明本文提出的壓力環(huán)傳感器測試索力的方法是可靠的，壓力環(huán)傳感器性能穩(wěn)定，測試結(jié)果準(zhǔn)確。同時(shí)從表4中可以看出：壓力環(huán)傳感器的測試結(jié)果較加速度傳感器的測試結(jié)果大。由于受到實(shí)驗(yàn)室條件的限制，本文的斜拉索索長均較短，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)可認(rèn)為加速度傳感器的測試結(jié)果誤差較大，這也在一定程度上反映了壓力環(huán)傳感器測試結(jié)果的精度較高。

由于亞麻脫膠關(guān)鍵酶是果膠酶和木聚糖酶，且纖維素酶活性相對較低和穩(wěn)定，即對亞麻脫膠影響相對較小，故主要對果膠酶和木聚糖酶進(jìn)行研究并作為主要考察因素。

由正交試驗(yàn)結(jié)果得到以下三種相對較優(yōu)發(fā)酵條件，并對其進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。發(fā)酵及煮煉參數(shù)如表3所示。

表3 因子水平表Tab.3 Factors and levels designed for degumming

圖2 發(fā)酵條件對纖維強(qiáng)度，失重率，分裂度的影響趨勢Fig.2 Trends of fiber strength，weight loss rate and splitting degree under different fermentation conditions

綜上，測定結(jié)果可以明顯得出亞麻脫膠菌DA10的最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵初始pH值為7，發(fā)酵溫度為40℃，時(shí)間為12h。

圖3 最佳發(fā)酵條件下煮練纖維掃描電鏡圖Fig.3 Fibers scanned on electron microscopy(SEM)under the best fermentation conditions

2.2 硫酸銨鹽析法對混合酶粗提取

圖4 鹽析后上清液果膠酶酶活曲線Fig.4 Curve of pectinase activity

由圖4可知，鹽析后上清液在硫酸銨飽和度為50%的時(shí)候，果膠酶相對酶活力開始急劇下降，至90%飽和度時(shí)基本接近平緩，故說明硫酸銨飽和度在50%至90%區(qū)間內(nèi)可大量析出果膠酶。

圖5 鹽析后上清液木聚糖酶酶活曲線Fig.5 Curve of xylanase activity

由圖5可知，鹽析后上清液在硫酸銨飽和度為20%的時(shí)候，木聚糖相對酶活力開始急劇下降，至40%飽和度時(shí)基本接近平緩，故說明硫酸銨飽和度在20%至40%區(qū)間內(nèi)可大量析出木聚糖酶。

2.3 細(xì)菌煮煉與酶脫膠對比結(jié)果

圖6 不同酶對亞麻粗紗失重率，分裂度及強(qiáng)度的影響趨勢Fig.6 Trends of weight loss rate，splitting degree，and strength of flax roving under different enzymes

由圖可以明顯看出，亞麻粗紗煮煉的總體效果:堿煮＞粗提混合酶 (果膠與木聚糖酶混合)＞發(fā)酵液＞商業(yè)單一酶。

3 小結(jié)與討論

3.1 通過正交實(shí)驗(yàn)方法對亞麻脫膠菌DA10發(fā)酵條件的研究，可以得出以下結(jié)論:pH對亞麻脫膠菌的發(fā)酵影響最大，其次是溫度，而時(shí)間對其影響相對較小。亞麻脫膠菌假單胞菌DA10發(fā)酵的最適條件是:發(fā)酵初始pH值為7，發(fā)酵溫度為40℃，時(shí)間為12h。

3.2 通過硫酸銨鹽析法得到的鹽析曲線的趨勢表明:硫酸銨飽和度在50%至90%區(qū)間內(nèi)可大量析出果膠酶;硫酸銨飽和度在20%至40%區(qū)間內(nèi)可大量析出木聚糖酶。

3.3 粗提混合酶亞麻粗紗煮煉的效果分別與純堿煮、發(fā)酵液和其他商業(yè)酶對比得出:粗提混合酶各項(xiàng)參數(shù)與堿煮相當(dāng)，比發(fā)酵液和其他商業(yè)單一酶高，粗提混合酶對亞麻粗紗煮煉效果相對較優(yōu)。生物處理亞麻粗紗對比純堿煮煉，亞麻紗明顯變得柔軟，表面也變得光滑，源于生物作用的溫和且污染較小。

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