煙草疫霉菌對劍麻重要防御酶活性影響的研究

趙艷龍，周文釗，李俊峰，楊玉梅

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江524091)

劍麻 (Agave sisalana)斑馬紋病是危害劍麻最嚴(yán)重的病害，其病原菌主要為煙草疫霉菌(Phytophthora nicotianae van Breda de Haan)［1，2，3］。大量研究表明，超氧化物岐化酶 (SOD)、多酚氧化酶 (PPO)、過氧化物酶 (CAT)是植物體內(nèi)的重要防御酶，參與活性氧清除及本酚類、木質(zhì)素和植保素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，與植物的抗病性密切相關(guān)［4，5，6］。關(guān)于劍麻保護(hù)酶的活性，僅有干旱、鹽與低溫脅迫條件下的少數(shù)幾篇報道［7，8］，對酶與劍麻抗病性的關(guān)系未見報道，本文以易感病劍麻品種H.11648為材料，在接種煙草疫霉菌前后，分別測定劍麻葉片中SOD、PPO、CAT活性，試圖分析病菌對劍麻生理反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步開展劍麻抗病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，對劍麻抗病育種工作有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

劍麻H.11648盆栽苗，50cm高;煙草疫霉菌由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種前酶活性測定

取6株生長基本一致的盆栽苗，其中3株作為對照，3株作為處理。從最下部開始，每株各割取一片完好的葉片，帶回實驗室，洗凈、晾干后，及時測定其SOD、PPO、CAT活性。

1.2.2 接種

將保存的煙草疫霉菌用PDA培養(yǎng)基活化，置于28℃生化培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7d，作為接種用，從麻苗最下部的葉片開始選擇完好葉片全部接種，接種位置距葉片基部10cm，接種時先用75%酒精消毒，刺傷表皮組織，將直徑6mm的菌塊帶菌絲一面貼于傷口 (對照的3株，將同樣大小的空白PDA貼于傷口)，用棉花保濕，置于28℃環(huán)境條件下培養(yǎng)。

1.2.3 接種后酶活性測定

分別于接種后連續(xù)5d，每天測定葉片的SOD、PPO、CAT活性。葉片取樣同1.2.1。

1.2.4 酶活性測定方法

SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法［9］，以每分鐘抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位;CAT活性測定采用比色法［10］，以每分鐘D240值變化0.01為一個酶活性單位;PPO活性測定采用鄰苯二酚法，反應(yīng)體系為:2.9ml0.05mol/L磷酸緩沖液 (pH值7.8)、1ml0.1mol/L鄰苯二酚，0.1ml酶液，加入酶液后于30℃保溫10min，立即加入2ml 20%(W/V)的TCA(三氯乙酸)終止反應(yīng)，測398nm OD值，以△OD398nm/g·Fw·min表示酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照劍麻的酶活性變化

不接種煙草疫霉菌的劍麻，其SOD、CAT、PPO三種酶的活性，在接種前后的變化情況見表1。經(jīng)方差分析，在接種培養(yǎng)基前后6d，三種酶的活性變化無顯著差異。

表1 對照的劍麻酶活性的變化情況Tab.1 Change of the important defensive enzyme activities of the control group

2.2 處理劍麻的酶活性變化

接種煙草疫霉菌的劍麻，其SOD、CAT、PPO三種酶的活性，分別如圖1、圖2和圖3所示。從圖1可見:H.11648麻在接種煙草疫霉菌前后6d內(nèi)，SOD活性變化不大，經(jīng)顯著性測驗表明，6d間的SOD活性無顯著差異。從圖2可見:H.11648麻在接種煙草疫霉菌后，前2d內(nèi)，CAT活性變化不大，但從第3d后明顯上升，至第5d達(dá)到高峰，顯著性測驗也驗證了該結(jié)論。從圖3可見:H.11648麻在接種煙草疫霉菌后，PPO活性，第1d顯著下降，第2d又顯著上升，第3d沒多大變化，第4d又顯著下降到最低點(diǎn)，但第5d又上升到最高點(diǎn)。表2對接種前后SOD、CAT、PPO活性的變化進(jìn)行了顯著性測定。

圖1 H.11648麻接種煙草疫霉菌后SOD活性變化Fig.1 Change of SOD contents of Agave hybrid No.11648 inoculated with P.nicotianae

圖2 H.11648麻接種煙草疫霉菌后CAT活性變化Fig.2 Change of CAT contents of Agave hybrid No.11648 inoculated with P.nicotianae

圖3 H.11648麻接種煙草疫霉菌后PPO活性變化Fig.3 Change of PPO contents of Agave hybrid No.11648 inoculated with P.nicotianae

表2 接種前后SOD、CAT、PPO酶活性變化情況Tab.2 Change of the important defensive enzyme activities of Agave hybrid No.11648 before and after inoculation

3 結(jié)論與討論

3.1 劍麻在用針刺傷后，貼上PDA培養(yǎng)基，其SOD、CAT、PPO的活性，前后6d都沒有明顯變化，說明針刺對劍麻表皮造成的微小傷口，不足以對劍麻內(nèi)部的生理生化等新陳代謝產(chǎn)生影響，因此，對葉片中的酶活性也較少影響。

3.2 接種煙草疫霉菌后，CAT活性前2d變化不大，但第3d顯著上升，至第5d達(dá)到高峰。這是因為CAT是一種活性氧清除劑，當(dāng)劍麻接種疫霉菌后，感病的劍麻組織會產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)，O2－積累，加速染病細(xì)胞死亡，限制病菌進(jìn)一步擴(kuò)展，隨后CAT上升，清除過多積累的O2－，避免造成膜脂過氧化傷害健康細(xì)胞，與劉琳［10］報道的結(jié)果相同。但SOD活性的變化規(guī)律與CAT活性的變化規(guī)律不同，它沒有顯著的變化，這與劉琳［10］、周小慧［11］、陳藝暉［12］等報道的結(jié)果不相符，但與苗則彥［13］報道的結(jié)果相同，需要留待以后繼續(xù)驗證。

3.3 多酚氧化酶 (PPO)是酚類物質(zhì)氧化的關(guān)鍵酶，參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生醌類和參與木質(zhì)素的合成，以殺死和抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用［14］。關(guān)于PPO與植物抗病性的關(guān)系，已見的報道各不相同［4，15，16］劍麻接種煙草疫霉菌后，PPO活性表現(xiàn)為先下降，后上升，再下降，又上升的特點(diǎn)，接種病原菌后1d，PPO活性受到一定的抑制，而后顯著上升，可能因為接種成功后，植物組織發(fā)生了激烈的反應(yīng)，因而PPO活性升高，以阻止病原菌的擴(kuò)展，但因為H.11648是高感品種，其抵抗力有限，至第4d又出現(xiàn)活性下降，第5d又出現(xiàn)周期性的上升。

3.4 關(guān)于SOD等抗性酶系統(tǒng)與植物抗病性的關(guān)系，前人研究了很多，但得出的結(jié)論各有異同，本文僅以高感品種H.11648為試材，對接種病原菌后，幾種防御酶的活性變化作了初步探討，為研究酶活性與劍麻抗病性的關(guān)系奠定了一定基礎(chǔ)。今后應(yīng)以多種抗性劍麻品種為材料，對其相關(guān)性作更深一步的研究，為指導(dǎo)劍麻抗病育種作出貢獻(xiàn)。

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