2010年—2011年山東近海石莼屬綠潮藻的種類鑒定

高姍姍，段維軍，陳先鋒，張慧麗，陳 炯，朱水芳

(1.寧波大學海洋學院寧波315211;2.寧波出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，寧波315012;3.中國檢驗檢疫科學技術研究院植物檢疫研究所，北京100121)

石莼屬(Ulva sp.，以往稱為石莼屬和滸苔屬)隸屬于綠藻門 (Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)［1，2］。廣泛分布在世界各大洋中，常生長在高低潮間帶的巖石上或石沼中，有時也可附生在大型海藻的藻體和船舶的外殼之上。綠潮(Green tides)是綠藻門大型海藻暴發(fā)性增殖或高度聚集，從而導致多方面次生危害的一種生態(tài)異常現(xiàn)象，絕大部分該類綠潮是由石莼屬綠藻所造成的，現(xiàn)已成為一種世界性的海洋環(huán)境問題。

近年來，中國山東近海連續(xù)發(fā)生大規(guī)模綠潮災害，對海洋生態(tài)系統(tǒng)、環(huán)境、資源與沿海經濟造成了不同程度的影響。2008年夏季，中國山東青島地區(qū)經歷了世界上迄今為止規(guī)模最大的一次綠潮災害。綠潮覆蓋面積13000平方公里，綠潮清理工作動用了過萬人員和1400余艘船只，清理出超過100余萬噸的綠潮藻［3，4］。2009年7月，青島再次爆發(fā)大規(guī)模綠潮災害，覆蓋面積達19000平方公里，持續(xù)時間超過一個月［5］。2010年7月初綠潮最大覆蓋面積和分布面積分別達到了530平方公里和29800平方公里［6］。2011年7月，綠潮最大覆蓋面積和分布面積分別達到了560平方公里和26400平方公里［7］。山東近海綠潮災害爆發(fā)面積大，持續(xù)時間長，大量涌入近岸海域，對漁業(yè)、水產養(yǎng)殖、海洋環(huán)境、景觀和生態(tài)服務功能產生了嚴重影響。

綠潮藻的種類鑒定是解決該類問題的首要步驟。然而，石莼屬綠藻，特別是漂浮石莼屬綠藻，由于其高度形態(tài)可塑性以及缺少可用于形態(tài)鑒定的特征，非常難于鑒定。近年來，根據(jù) internal transcribed spacer(ITS)片段或者large subunit of the ribulose-bisphosphate carboxylase(rbcL)等片段序列分析結果，對石莼屬內種類劃分方面已經取得了長足進展［1］。在以往對2008年—2009年綠潮藻種類鑒定研究中，根據(jù)漂浮綠潮藻高度分枝和中空的形態(tài)特征，綠潮藻被鑒定為U.prolifera［8］，根據(jù)系統(tǒng)進化分析研究，有研究報告指出該綠潮藻屬于 U.linza-procera-prolifera(LPP)分枝［9］，也有結合形態(tài)學觀察或雜交試驗結果報道其為U.prolifera［10］，但是Kim等的研究卻指出該綠潮藻為U.linza［11］。山東近海綠潮災害連年爆發(fā)，其2010年和2011年種類組成是否發(fā)生變化，對此尚未有研究予以解決。準確地綠潮種類組成鑒定對于其防控工作開展以及追溯其來源具有重要意義，為此我們開展了本項研究。

表1 采集石莼屬樣品信息Table 1 The information of collected Ulva samples

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理

于2010年—2011年在山東近海綠潮發(fā)生地采集石莼屬樣品，樣品信息見表1。采用無菌水仔細清洗新鮮藻體，洗去泥砂和其它附著物，用吸水紙吸干表面水分，儲存于4℃條件下，用于形態(tài)學觀察和DNA提取。

1.1.2 試劑

Taq 酶、MgCl2、10 × PCR buffer、DL2000 Marker、DNA片段純化試劑盒和凝膠純化試劑盒、pMD19-T載體均購自寶生物(Takara);Plant Genomic DNA Kit試劑盒購自天根公司;實驗用引物由上海英俊合成;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察

形態(tài)學觀察的標準參照Duan等［12］方法進行。

1.2.2 基因組DNA的提取

利用天根Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN.，China)試劑盒，按照試劑盒說明書進行基因組DNA的提取。

1.2.3 ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列的擴增及克隆

用于ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列擴增的引物、PCR反應體系及反應條件參照Duan等［12］方法進行。PCR擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列的基因克隆，挑選陽性克隆送上海英俊生物技術有限公司測序。

圖1 滸苔樣品2011S62A的形態(tài)特征Fig 1 Microscopic details of Ulva prolifera，2011S62A

表2 根據(jù)形態(tài)特征31株黃海采集石莼屬樣品分屬于3種不同形態(tài)類群Table 2 Based on morphology，the 31 samples of Ulva spp.from the Shangdong Coast can be divided into three groups

圖2 孔石莼樣品2011S65B的形態(tài)特征Fig 2 Microscopic details of Ulva pertusa，2011S65B

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載用于石莼屬ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列分析的序列。將測得的序列與Genbank中下載的序列用CLUSTAL X程序進行同源性分析，使用MEGA5.0軟件［13］中的鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)進化樹，重復1000次計算Bootstrap值。

2 結果

2.1 形態(tài)學特征

樣品2010S44等，共計18個，占供試樣品的58%，其形態(tài)特征與 Tseng 等［14］、Heesch 等［15］描述的滸苔(U.prolifera)的形態(tài)特征基本一致(表2，圖1)。樣品2010S43等，共計12個，占供試樣品的38.7%，其形態(tài)特征與 Tseng 等［14］、Heesch 等［16］、Aguilar-Rosas 等［17］描述的孔石莼(U.pertusa)的形態(tài)特征基本一致(表2，圖2)。樣品2010S49，共計1個，占供試樣品的3.2%，形態(tài)特征與 Tseng 等［14］，Blomster等［18］描述的扁滸苔(U.compressa)的形態(tài)特征基本一致(表2，圖3)。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 ITS和rbcL系統(tǒng)進化發(fā)育分析

ITS片段由870 bp左右堿基構成，而rbcL片段長度約為1270 bp。31株山東近海收集的石莼屬樣品被劃分到3個不同的分枝。最大的一個分枝包括18個樣品，包含2010年綠潮藻樣品5株和2011年綠潮藻樣品13株，它所獲得的 bootstrap值分別為100/100(ITS/rbcL);12株樣品屬于 U.pertusa分枝，bootstrap值分別為100/100(ITS/rbcL);樣品2010S49屬于U.compress分枝，bootstrap值分別為100/100(ITS/rbcL)(圖4、圖5)。

圖5 根據(jù)石莼屬rbcL序列采用鄰接法構建的系統(tǒng)進化樹Fig 5 Phylogenetic tree of the neighbor-joining(NJ)analysis inferred from the nuclear encoded rbcL regions of Ulva

2.2.2 5S rDNA間隔序列的系統(tǒng)進化發(fā)育分析

5S rDNA間隔序列片段由445 bp左右堿基構成，根據(jù)5S rDNA間隔序列片段的分析構建了系統(tǒng)進化樹。18株屬于LPP分枝的樣品均被劃分到了U.prolifera分枝，其bootstrap支持值為100，在所采集的漂浮樣品中沒有發(fā)現(xiàn)緣管滸苔U.linza(圖6)。

圖6 根據(jù)石莼屬5S rDNA間隔區(qū)序列采用鄰接法構建的無根系統(tǒng)進化樹Fig 6 Unrooted neighbor-joining(NJ)tree of the 5S rDNA spacer region of the LPP clade

3 結論與討論

對于石莼屬物種鑒定，僅使用形態(tài)學方法面臨一些問題。石莼屬形態(tài)特征復雜，少數(shù)形態(tài)特征會隨環(huán)境的變化而變化，如U.intestinalis通常沒有分枝，而U.compressa有分枝，但是低鹽或鹽休克可以誘導U.intestinalis形成分枝［18］。同時，傳統(tǒng)分類學家數(shù)量在逐漸減少，針對某一特定類群專家相對更少。目前對于石莼屬種類的鑒定已經越來越多的借助于分子生物學的方法，通過使用DNA序列分析的方法推斷類群間系統(tǒng)發(fā)育關系，結合形態(tài)學特征，完成物種鑒定，這一技術彌補了傳統(tǒng)分類方法的不足。

盡管ITS和rbcL序列能夠將石莼屬內大多數(shù)種類區(qū)分開，表現(xiàn)出其在石莼屬種類劃分中的重要作用，但對于LPP(U.linza-procera-prolifera)分枝中的U.linza、U.procera(現(xiàn)已被劃分為 U.linza 的同物異名)［2］和U.prolifera卻無法起到很好的辨別作用。為此我們采用了一個更加靈敏的分子標記——5S rDNA間隔序列標記，Shimada等人的研究證實了5S rDNA間隔區(qū)對于石莼屬中LPP分枝中滸苔和緣管滸苔的準確劃分有著重要作用［19］。結合本實驗的結果，5S rDNA間隔序列成功地將緣管滸苔和滸苔區(qū)分開來，明確了本研究中采集的18株漂浮樣品均為滸苔U.prolifera，滸苔仍然是2010年—2011年間山東近海漂浮綠潮的優(yōu)勢種群。

綠潮的發(fā)生通常都是由一種或幾種石莼屬綠藻構成，更好的對綠潮藻種類組成進行研究對于解決綠潮問題至關重要。在本研究中，我們采用形態(tài)學觀察結合分子生物學的方法對2010年—2011年山東近海黃海海域綠潮藻的種類進行了鑒定。通過ITS和rbcL的序列分析，我們發(fā)現(xiàn)從山東近海19個不同地點收集的31株石莼屬樣品可以劃分為3個不同的分枝:LPP分枝、孔石莼分枝和扁滸苔分枝，固著藻和漂浮藻樣品中均有孔石莼的存在。為確定LPP分枝中18株漂浮藻的最終分類地位，我們進一步進行了5S rDNA間隔序列的序列分析，結果發(fā)現(xiàn)18株漂浮藻均為滸苔U.prolifera。因此，2010年—2011山東近海綠潮種類組成包括滸苔 U.prolifera、孔石莼 U.pertusa和扁滸苔 U.compressa。本研究表明多種石莼屬綠藻共同構成了2010年—2011年山東近海的綠潮災害，其不同種類所占比例也有所不同，該結果為進一步查明山東近海綠潮來源提供了重要信息。綠潮藻種類組成對于綠潮發(fā)生發(fā)展起到何種作用尚需進一步研究。

為查明本國石莼屬資源，防范外來有害生物或綠潮災害的發(fā)生，一些發(fā)達國家，如新西蘭［15］、日本［19］等已經對其周邊海域內石莼屬綠藻進行了詳盡的調查與分析，明確了具體種類。石莼屬綠藻迄今全世界已報道種類約有100種［2］，但中國有文獻報道記載的石莼屬綠藻種類僅有10余種［14］。中國海岸線遼闊，氣候多變，地理跨度大，海洋資源對國家發(fā)展意義重大，很有必要開展石莼屬綠藻資源調查工作。

［1］Hayden H，Blomster J，Maggs C，et al.Linnaeus was right all along:Ulva and Enteromorpha are not distinct genera［J］.European Journal of Phycology，2003，38:277-294.

［2］Guiry M D，Guiry G M.Algae base.world-wide electronic publication，National University of Ireland，Galway.http://www.algaebase.org;searched on 14 February 2012.

［3］李 杰.青島滸苔變身紀念品［N］.中國海洋報，20080822期，http://epaper.oceanol.com/shtml/zghyb/20080822/56946.shtml.

［4］王秋蓉，唐少曼.青島打撈滸苔超過18萬噸［N］.中國海洋報，20080704期，http://epaper.oceanol.com/zghyb/20080704/index.htm.

［5］唐少曼.黃海滸苔陸續(xù)在威海、煙臺和青島登岸［N］.中國海洋報，20090724 期，http://epaper.oceanol.com/shtml/zghyb/20090724/61771.shtml.

［6］國家海洋局.2010年中國海洋災害公報［R］.2011，http://www.soa.gov.cn/soa/hygbml/zhgb/ten/webinfo/2011/04/1303019794623623.htm.

［7］國家海洋局.2011年中國海洋災害公報［R］.2012，http://www.soa.gov.cn/soa/hygbml/zhgb/eleve/webinfo/2012/07/1341188579657459.htm.

［8］牛建峰，范曉蕾，潘光華，等.青島海域大面積聚集漂浮滸苔的顯微觀測［J］.海洋科學，2008，32(8):30-33.

［9］Leliaert F，Zhang X，Ye N，et al.Research note:identity of the Qingdao algal bloom［J］.Phycological Research，2009，57(2):147-151.

［10］Hiraoka M，Ichihara K，Zhu W，et al.Culture and hybridization experiments on an Ulva clade including the Qingdao strain blooming in the Yellow sea［J］.PLoS ONE，2011，6(5):e19371.

［11］Kim J H，Kang E J，Park M G，et al.Effects of temperature and irradiance on photosynthesis and growth of a green-tide-forming species(Ulva linza)in the Yellow Sea［J］.Journal of Applied Phycology，2011，23(3):421-432.

［12］Duan W，Guo L，Sun D，et al.Morphological and molecular characterization of free-floating and attached green macroalgae Ulva spp.in the Yellow Sea of China［J］.Journal of Applied Phycology，2012，24(1):97-108.

［13］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28:2731-2739.

［14］Tseng C K.Common seaweeds in China［M］.1983，Beijing:Science Press.

［15］Heesch S，Broom J E S，Neill K F，et al.Ulva，Umbraulva and Gemina:genetic survey of New Zealand taxa reveals diversity and introduced species［J］.European Journal of Phycology，2009，44(2):143-154.

［16］Heesch S，Broom J，Neill K，et al.Genetic diversity and possible origins of New Zealand populations of Ulva［R］.Biosecurity New Zealand Technical Paper No:2007/01，2007.

［17］Aguilar-Rosas R，Aguilar-Rosas L E，Shimada S.First record of Ulva pertusa Kjellman(Ulvales，Chlorophyta)in the Pacific Coast of Mexico［J］.Algae，2008，23(3):201-207.

［18］Blomster J，Maggs C A，Stanhope M J.Molecular and morphological analysis of Enteromorpha intestinalis and E.compressa(Chlorophyta)in the British Isles［J］.Journal of Phycology，1998，34(2):319-340.

［19］Shimada S，Yokoyama N，Arai S，et al.Phylogeography of the genus Ulva(Ulvophyceae，Chlorophyta)，with special reference to the Japanese freshwater and brackish taxa［J］.Journal of Applied Phycology，2008，20(5):979-989.