基因組文庫(kù)的研究進(jìn)展

王美玲，吳茜茜，蔡敬民，

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036;2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601)

從孟德?tīng)柕倪z傳規(guī)律到Watson-Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，再到人類(lèi)基因組計(jì)劃和植物基因組計(jì)劃的實(shí)施，其研究從細(xì)胞染色體水平深入到DNA大分子水平，再進(jìn)入反向生物學(xué)階段。1920年，Winkles［1］提出了genome，由 gene和chromosomes兩個(gè)單詞組合而成，表明生物信息是由基因和染色體組成。隨著生物科學(xué)的迅速發(fā)展，生物學(xué)家們對(duì)基因組DNA研究的中心任務(wù)由一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因逐步轉(zhuǎn)向整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)以及功能的研究，基因組文庫(kù)應(yīng)運(yùn)而生。通過(guò)幾十年的發(fā)展，基因組文庫(kù)為開(kāi)展基因組的分化組成、基因的表達(dá)與調(diào)控、染色體區(qū)段的分子物理作圖等領(lǐng)域的研究和基因的克隆提供技術(shù)平臺(tái)。

1 基因組文庫(kù)的分類(lèi)

基因組文庫(kù)種類(lèi)繁多，按插入片段的大小可將其分為小于100Kb的小片段基因組文庫(kù)(cosmid、fosmid等)和100Kb及其以上的大片段基因組文庫(kù)(BAC、YAC等)。同時(shí)基因組文庫(kù)按其載體種類(lèi)大致可分為噬菌體系列，如早期的λ噬菌體、cosmid、P1噬菌體和fosmid等;20世紀(jì)80年代起構(gòu)建的人工染色體系列，如YAC、BAC等，及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的多元載體BIBAC和TAC。幾種克隆載體性質(zhì)的比較見(jiàn)表1。

2 噬菌體系列

2.1 λ噬菌體文庫(kù)

λ噬菌體是噬菌體改造成載體中應(yīng)用最為廣泛的，是基因組大小約49 Kb的線性雙鏈DNA噬菌體。DNA雙向復(fù)制機(jī)理的揭示、轉(zhuǎn)錄終止和抗終止作用蛋白質(zhì)的分離、DNA連接酶和促旋酶的發(fā)現(xiàn)和SOS修復(fù)機(jī)理的闡明等，都是以λ噬菌體為材料做出的重要成果。λ噬菌體是基因組文庫(kù)構(gòu)建中使用較早的載體，插入片段理論極限為23 Kb，雖容載有限，但為進(jìn)一步構(gòu)建大片段插入文庫(kù)奠定了基礎(chǔ)，許多cDNA文庫(kù)也是以λ噬菌體作為克隆載體構(gòu)建的。例如，李南羿等以λGEM-11為載體構(gòu)建了草菇基因組文庫(kù);張潔［2］等成功構(gòu)建重組率為100%的藜草花粉變應(yīng)原λ噬菌體cDNA表達(dá)文庫(kù);朱靖［3］等針對(duì)λ噬菌體cDNA文庫(kù)效率低下、篩選等問(wèn)題，利用λTripEx2噬菌體能自身環(huán)化成質(zhì)粒pTripEx2的原理將λ噬菌體cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化成質(zhì)粒cDNA文庫(kù);尚毅［4］等用液體分裝代替涂板分區(qū)改進(jìn)了基于PCR的篩庫(kù)方法，提高了篩選速度和效率，實(shí)現(xiàn)了cDNA文庫(kù)的功能性篩選。

表1 克隆載體的種類(lèi)及特點(diǎn)Table 1 The types and characteristics of the cloning vector

2.2 cosmid文庫(kù)

1978年，Collins等人構(gòu)建了柯斯質(zhì)粒載體，僅以λDNA兩端包裝噬菌體必需的cos序列，加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等構(gòu)成，因此具有λ噬菌體和質(zhì)粒的特點(diǎn)，在宿主細(xì)胞內(nèi)以λ噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化，與其他大腸桿菌宿主載體系統(tǒng)(BACs等)相比操作簡(jiǎn)單［5］。Cosmid文庫(kù)插入片段極限可達(dá)45 Kb，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳、基因克隆、測(cè)序和圖譜制作等研究中。彭開(kāi)蔓和張啟發(fā)構(gòu)建了優(yōu)良水稻品種“明恢63”基因組的cosmid文庫(kù);易厚富等構(gòu)建水稻廣親和品種核DNA cosmid文庫(kù)并分離得到一個(gè)位于水稻廣親和基因座S5附近的克隆R2I19;李敏等構(gòu)建了蜘蛛基因組DNA cosmid文庫(kù)并克隆了拖絲蛋白基因;安洋［6］等致力于研究紅色紅曲霉基因組cosmid文庫(kù)大片段DNA的制備;王雅麗［7］等構(gòu)建了小球藻南極株和溫帶株基因組的cosmid文庫(kù)。但cosmid和λ噬菌體文庫(kù)很難完成大量疊連序列的組裝及哺乳動(dòng)物基因組物理圖譜的構(gòu)建，從而限制了它的應(yīng)用。

2.3 P1噬菌體文庫(kù)和PAC文庫(kù)

1990年能高效擴(kuò)增較大基因組片段(90-100Kb)P1噬菌體文庫(kù)被研制出來(lái)［8］，P1噬菌體的生物學(xué)特性、與黏粒相似的原理、裝備的標(biāo)記基因等輔助原件，使得文庫(kù)能涵蓋哺乳動(dòng)物基因組。在P1噬菌體文庫(kù)的基礎(chǔ)上，1994年Ioannou等將噬菌體P1和F因子系統(tǒng)相結(jié)合構(gòu)建了PAC文庫(kù)。PAC文庫(kù)通過(guò)電激穿孔導(dǎo)入而非像P1噬菌體文庫(kù)一樣通過(guò)包裝或特異位點(diǎn)重組的方式導(dǎo)入大腸桿菌，其插入片段為100-300 Kb。P1噬菌體文庫(kù)與PAC文庫(kù)都沒(méi)有明顯的嵌合和缺失現(xiàn)象，有較高的遺傳穩(wěn)定性，能高效擴(kuò)增，外源DNA易分離。Gingrich等構(gòu)建了人類(lèi)第二條染色體的PAC文庫(kù);日本水稻基因組計(jì)劃(RGP)已將水稻的PAC文庫(kù)用于物理圖譜的構(gòu)建［9］。

2.4 fosmind文庫(kù)

1992年，Kim等用 BAC載體的前體 pBAC引入pUCcos改造cosmid載體，使其成為能夠穩(wěn)定搭載大小約45 kb DNA片段的fosmid載體。Fosmid是現(xiàn)在流行的構(gòu)建文庫(kù)的新載體，構(gòu)建時(shí)不采用限制性酶切，從而避免了酶切位點(diǎn)的偏好性，拷貝數(shù)低且復(fù)制穩(wěn)定，插入片段大小適中，篩選方便等特點(diǎn)使得fosmid文庫(kù)廣泛地應(yīng)用于基因的位圖克隆、物理圖譜的構(gòu)建和比較基因組學(xué)中。近年來(lái)使用fosmid構(gòu)建文庫(kù)的研究不斷增多，如土壤環(huán)境;紅曲菌、鰻弧致病菌［10］等微生物;白菜［11］、對(duì)蝦［12］等動(dòng)植物;Beta-Lactamase Gene、Opp 基因簇等具有研究意義的基因。樊帆［13］等基于Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)，使用標(biāo)簽和標(biāo)簽接頭，成功構(gòu)建了高通量低成本的fosmid文庫(kù);趙心清等通過(guò)構(gòu)建fosmid文庫(kù)篩選獲得一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因及其修飾產(chǎn)物的生物合成基因簇。

3 人工染色體系列

3.1 YAC文庫(kù)

YAC是最早發(fā)展的真正意義上的人工染色體，插入片段理論上可達(dá)2 Mb左右，能覆蓋完整的基因組。YAC最初由Murray等人提出并首次構(gòu)建55 kb包括著絲粒、端粒、復(fù)制子和外源DNA的YAC，美國(guó)華盛頓大學(xué)Burke等人首先完成了人類(lèi)基因組的YAC文庫(kù)。YAC簡(jiǎn)化了構(gòu)建染色體延伸區(qū)域圖譜和分離完整基因的過(guò)程;能構(gòu)建大的人類(lèi)基因區(qū)段;為真核生物DNA提供了更合適的環(huán)境，能夠克隆某些在細(xì)菌中不能克隆的DNA區(qū)段，是分離和制備人類(lèi)染色體圖譜應(yīng)用最多的體系。人類(lèi)已建成“百萬(wàn)堿基級(jí)”YAC文庫(kù)，X、Y、21號(hào)染色體YAC文庫(kù)等，相繼獲得、分離和分析了乳腺癌基因、囊性纖維變性基因等人類(lèi)基因。小鼠、擬南芥、水稻等模式生物YAC文庫(kù)已構(gòu)建和使用，番茄、桑蠶等經(jīng)濟(jì)作物和功能基因(免疫球蛋白k鏈基因)的YAC文庫(kù)已建立，還進(jìn)一步對(duì)YAC本身進(jìn)行改良研究［14］。

3.2 BAC文庫(kù)

1992年Shizuya等構(gòu)建了第一個(gè)BAC載體pBAC108L，開(kāi)創(chuàng)了BAC文庫(kù)的紀(jì)元。BAC文庫(kù)插入片段約300 kb，轉(zhuǎn)化率高，遺傳穩(wěn)定，幾乎不存在嵌合現(xiàn)象等特點(diǎn)成為近幾年應(yīng)用最廣泛的大片段基因組文庫(kù)。多種植物(包括大多數(shù)重要農(nóng)作物)、微生物、動(dòng)物甚至線粒體等細(xì)胞器的BAC文庫(kù)已構(gòu)建使用，從傳統(tǒng)的水稻、小鼠等模式生物到稀有的或有研究?jī)r(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種;從構(gòu)建整個(gè)基因組到對(duì)部分基因的深入探索，從水生到陸生，從簡(jiǎn)單到復(fù)雜。如國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)揚(yáng)子鱷、食蟹猴［15］、蕪菁［16］、鏈霉菌［17］等展開(kāi)研究并獲得一定的成果。BAC對(duì)整個(gè)分子生物學(xué)的發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)，對(duì)基因克隆和基因資源的保存起著重要的作用，但是現(xiàn)在高通量測(cè)序技術(shù)降低了BAC文庫(kù)的利用率，夏正俊等建立了無(wú)網(wǎng)格BAC文庫(kù)及其陽(yáng)性克隆篩選的方法，解決了現(xiàn)有無(wú)網(wǎng)格BAC文庫(kù)程序復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、假陽(yáng)性等問(wèn)題。高海燕等首次通過(guò)非暗培養(yǎng)構(gòu)建了棉花BAC文庫(kù)，簡(jiǎn)化了構(gòu)建工序，節(jié)約了材料用量，這一方法適用于所有棉花種。

3.3 MAC文庫(kù)

哺乳動(dòng)物人工染色體(MAC)的構(gòu)建和使用在多年前曾被認(rèn)為是極端的理想主義，但YAC的研究成功及人類(lèi)基因組YAC文庫(kù)的構(gòu)建，對(duì)構(gòu)建MAC是一個(gè)極大的鼓舞。MAC能容納大于1000 Kb的外源DNA，能為大而復(fù)雜的基因提供自主復(fù)制的轉(zhuǎn)移載體，甚至能精確提供有絲分裂和減數(shù)分裂所需的染色體，因此可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中染色體功能的研究和體細(xì)胞基因治療［18］。MAC的基本元件包括復(fù)制起點(diǎn)、端粒和著絲粒。哺乳動(dòng)物染色體的復(fù)制起點(diǎn)不只一個(gè)，一條染色體上可能有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，且長(zhǎng)短不等，這些都增加了對(duì)其分離和結(jié)構(gòu)與功能研究的難度。端?？赡軈⑴c間期細(xì)胞核三維結(jié)構(gòu)的建成并保證染色體末端的穩(wěn)定復(fù)制，目前已被分離出。而著絲粒的分離要困難得多，著絲粒對(duì)于染色體在有絲分裂中的精確定位和分離起重要作用。人的著絲粒大且復(fù)雜，Y染色體著絲粒包括大量串聯(lián)重復(fù)的αDNA(24-1600 Kb)，兩側(cè)還排列著一些微衛(wèi)星和局部重復(fù)順序。近年來(lái)在闡明著絲粒功能，克隆著絲粒DNA以及分離跟著絲粒功能有關(guān)的蛋白等方面已經(jīng)取得了不少進(jìn)展。

3.4 HAC文庫(kù)

HAC即人類(lèi)人工染色體，第一個(gè)有絲分裂穩(wěn)定的人類(lèi)人工染色體是由克隆的人類(lèi)α衛(wèi)星DNA和端粒序列及其他基因組DNA轉(zhuǎn)染HT1080纖維肉瘤細(xì)胞獲得的。1998年Ikeno等人用構(gòu)建YAC的方法來(lái)構(gòu)建HAC:21號(hào)染色體上的100 Kb左右的人類(lèi)I型α衛(wèi)星DNA(α-21-I)被克隆到Y(jié)AC載體并翻新了人類(lèi)著絲粒的序列。HAC大小為1-5 Mb，原位雜交顯示插入環(huán)狀DNA發(fā)生多聚化是普遍的并確定HAC不需要宿主細(xì)胞末端著絲粒的DNA序列來(lái)促使游離基因修復(fù)成有絲分裂穩(wěn)定的DNA［19］。HAC在研究轉(zhuǎn)基因和基因組功能方面是潛力載體，在克隆、操縱和轉(zhuǎn)移大片段基因組時(shí)具有穩(wěn)定性，目前主要應(yīng)用于基因治療和干細(xì)胞研究。隨著人類(lèi)人工染色體的發(fā)展，大片段基因組導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞仍被高分子DNA的制備和低拷貝新生HAC的結(jié)構(gòu)所限制。到目前為止，僅有少數(shù)報(bào)導(dǎo)過(guò)大片段基因組成功包裹進(jìn)新生的HAC中。

4 第三代人工染色體

4.1 BIBAC文庫(kù)

1996年，Hamilton等結(jié)合BAC和根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的特點(diǎn)，構(gòu)建了一種能在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭復(fù)制的“雙元”BAC載體BIBAC。BIBAC具有植物選擇標(biāo)記、能夠直接轉(zhuǎn)化植物、重組子篩選便利、轉(zhuǎn)化率和克隆效率較高。1999年Hamiton等構(gòu)建了西紅柿的BIBAC文庫(kù)，隨后擬南芥、藥用野生稻、香蕉等的BIBAC文庫(kù)也被相繼構(gòu)建，其克隆片段在不同農(nóng)桿菌中的遺傳穩(wěn)定性、載體DNA的高效制備等相關(guān)方面也有一定的研究。程在全［20］等發(fā)明了BIBAC基因文庫(kù)混合池及混合池和基因的快速篩選方法，并成功構(gòu)建水稻滲入系以便快速、準(zhǔn)確的發(fā)掘優(yōu)良基因。

4.2 TAC文庫(kù)

劉耀光等人結(jié)合PAC和雙元載體的特點(diǎn)的建立起了可轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)TAC，構(gòu)建了pYLTAC7。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的系列載體如pYLTAC17以水稻肌動(dòng)蛋白ActⅠ為強(qiáng)啟動(dòng)子，bar基因?yàn)橹参镞x擇標(biāo)記基因，適合禾本科作物轉(zhuǎn)化體的選擇;pYLTAC27以Act iv為啟動(dòng)子，hpt為篩選標(biāo)記基因，可以高效應(yīng)用于單子葉植物的基因圖位克隆及功能分析。目前已經(jīng)構(gòu)建了擬南芥、水稻、金魚(yú)草、稻瘟菌［21］等的 TAC 文庫(kù)，并應(yīng)用TAC文庫(kù)分離及克隆出多個(gè)功能基因;或構(gòu)建同一種屬的不同物種的文庫(kù)來(lái)比較其基因差異并利用文庫(kù)研究資源的遺傳保護(hù)。

5 展望

基因組文庫(kù)是研究基因的重要工具及手段，克隆載體系統(tǒng)和基因組文庫(kù)的發(fā)展推動(dòng)基因組學(xué)及相關(guān)學(xué)科如遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等的發(fā)展。質(zhì)粒和噬菌體文庫(kù)的產(chǎn)生和發(fā)展為后續(xù)人工染色體系列文庫(kù)的產(chǎn)生和發(fā)展奠定了基礎(chǔ);cosmid和fosmid文庫(kù)增加了容載大小;YAC文庫(kù)的產(chǎn)生不僅彌補(bǔ)了容量小的缺點(diǎn)，還解決了真核生物表達(dá)的許多問(wèn)題;BAC文庫(kù)彌補(bǔ)了YAC文庫(kù)穩(wěn)定性差和嵌合現(xiàn)象，并以構(gòu)建方便和操作簡(jiǎn)單成為了基因組研究應(yīng)用最廣泛、最主要的克隆工具;MAC和HAC文庫(kù)大片段轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物染色體的能力具有廣泛的研究前景;BIBAC和TAC文庫(kù)的發(fā)展，標(biāo)志著基因多元化載體的研究，不僅加速了植物基因組研究、圖位克隆和功能分析，還對(duì)多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展起了肯定的作用，對(duì)植物基因工程具有重要意義。多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將會(huì)成為今后基因工程的重點(diǎn)，未來(lái)是多基因工程的時(shí)代。

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