鹽酸吡咯列酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈基質(zhì)金屬蛋白酶－9表達(dá)的影響

姚曉偉，潘軍強(qiáng)，周 鑫，韓穩(wěn)琦，李國(guó)良(陜西省人民醫(yī)院心臟內(nèi)二科，西安 70068;西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;通訊作者，E-mail:xiaowei_yao@cn.com)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)相關(guān)疾病是目前人群死亡的首位原因，在我國(guó)發(fā)病率、致殘率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，目前公認(rèn)為AS是一種大、中型動(dòng)脈血管的慢性非特異性炎癥病變［1］?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類依賴于鋅、鈣離子的內(nèi)肽酶［2］，至少已發(fā)現(xiàn)有23個(gè)成員［3］，MMP-9是其家族成員之一。相關(guān)研究報(bào)道，MMP-9可能通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂［4］，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用［5］。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是近年來(lái)備受推崇的一類治療糖尿病的新藥，相關(guān)研究表明其可通過(guò)激動(dòng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)而抑制許多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出抗AS作用［6－9］。本研究以 AS易感動(dòng)物，遺傳性高脂血癥(Watanabe heritable hyperlipidemic，WHHL)兔為研究對(duì)象，給予高膽固醇飲食同時(shí)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型后觀察新型噻唑烷二酮類藥物鹽酸吡格列酮對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)的影響，探討噻唑烷二酮類藥物抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，為此類藥物用于人類動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品

本組選擇新西蘭兔36只，雄性，1月齡，體重1.3－1.6 kg，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將兔實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料1周后，稱重，隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組12只，飼喂正常飼料120 g/d;高膽固醇飲食組12只，飼喂高膽固醇飼料120 g/d;高膽固醇飲食加吡咯列酮組12只，高膽固醇飼料120 g/d+吡格列酮8 mg/(kg·d)灌胃，喂養(yǎng)8周后處死各組動(dòng)物。高膽固醇飼料按照西方飲食飼料配方:膽固醇2%，蛋黃粉5%，豬油8%，基礎(chǔ)飼料85%。鹽酸吡格列酮片(瑞彤)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20040631，15 mg/片。生產(chǎn)批號(hào):08042151。

1.2 試劑及儀器

基質(zhì)金屬蛋白酶－9抗體(anti-MMP-9)，產(chǎn)品規(guī)格:濃縮液(1 mg/ml)親和純化抗體，產(chǎn)品編號(hào):bs-0397R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PV-6000通用型二步法免疫酶標(biāo)組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。0.01 mol/L PBS緩沖液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。光學(xué)顯微鏡(BX-51型)OLYMPUS，Japan。病理圖文分析系統(tǒng)PIPS2000，重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 標(biāo)本取材及留取

以上各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別在預(yù)定實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)給予耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg全身麻醉后左心室取血5 ml并注入空氣20 ml空氣栓塞處死動(dòng)物。血液注入不含抗凝劑普通試管，靜置后離心分離血清。立即開(kāi)胸并剪開(kāi)右心房，自左心室灌注福爾馬林固定主動(dòng)脈;分離主動(dòng)脈，取出從近主動(dòng)脈弓部到髂動(dòng)脈分叉處全部主動(dòng)脈，清除血管外組織，生理鹽水沖洗，置于中性甲醛緩沖液中固定。

1.4 HE染色及Masson染色鏡下觀察

對(duì)各組兔的主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色，鏡下觀察病理切片形態(tài)，泡沫細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)，纖維帽形成，膠原纖維增殖及融合，病灶深部可見(jiàn)壞死崩潰物等情況，從HE染色片上隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用朗珈PAS9000病理分析系統(tǒng)對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜厚度及內(nèi)膜/中膜(IMT)進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)Masson染色觀察動(dòng)脈硬化分級(jí):0級(jí)，正常血管;1級(jí)，少于50%的外膜受累，內(nèi)膜增生占管腔不超過(guò)20%;2級(jí)，50%－100%的外膜受累輕度纖維化，內(nèi)膜增生不超過(guò)管腔的20%;3級(jí)，100%外膜受累，中度纖維化，內(nèi)膜增生占管腔的20%－50%;4級(jí)，100%外膜受累，重度纖維化，內(nèi)膜增生達(dá)管腔的50%－80%;5級(jí)，全部管腔閉鎖。

1.5 MMP-9免疫組化特異性染色鏡下觀察

免疫組織化學(xué)染色法觀察主動(dòng)脈血管內(nèi)皮MMP-9表達(dá)。結(jié)果判定:MMP-9陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜棕黃色顆粒，隨機(jī)選取4個(gè)視野，200倍鏡下觀察，圖像分析采用病理組織實(shí)時(shí)攝像顯微鏡系統(tǒng)攝像，并使用圖像分析軟件分析陽(yáng)性面積百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 三組間動(dòng)脈壁及AS斑塊HE染色的比較

正常對(duì)照組動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮下無(wú)脂質(zhì)沉積或斑塊形成。高膽固醇飲食組，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)膜下的脂質(zhì)沉積明顯，脂質(zhì)斑塊及纖維帽形成，纖維帽下可見(jiàn)大量壞死崩解物質(zhì)，斑塊底部少量肉芽組織，少量淋巴細(xì)胞及泡沫細(xì)胞，血管平滑肌排列紊亂，中膜因斑塊壓迫、SMC萎縮，彈力纖維破壞變薄。高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動(dòng)脈板塊表面大量SMC和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的纖維帽，其下可見(jiàn)數(shù)量不等的泡沫細(xì)胞及炎細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞輕度減少;內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉積，可見(jiàn)血管平滑肌細(xì)胞增生，排列較規(guī)整，核略腫脹，彈力纖維、膠原纖維輕度增生(圖1)。

圖1 不同組別動(dòng)脈壁及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊HE染色 (×100)Figure 1 Hematoxylin staining of arterial wall and aortic AS plaque in three groups (HE，×100)

2.2 三組間動(dòng)脈壁及AS斑塊Masson染色比較

正常對(duì)照組動(dòng)物主動(dòng)脈硬化為0級(jí)，高膽固醇飲食組動(dòng)物主動(dòng)脈硬化4級(jí)以上，高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動(dòng)脈硬化3－4級(jí)(圖2)。

圖2 動(dòng)脈壁及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊Masson染色 (×100)Figure 2 Masson staining of arterial wall and aortic AS plaque in three groups (Masson staining，×100)

2.3 三組間MMP-9特異性染色表達(dá)陽(yáng)性面積比比較

高膽固醇飲食加吡咯列酮組、高膽固醇飲食組MMP-9陽(yáng)性面積比(陽(yáng)性染色面積/斑塊總面積)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);高膽固醇飲食加吡咯列酮組MMP-9陽(yáng)性面積比明顯低于高膽固醇飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1，圖3)。

圖3 動(dòng)脈壁及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊MMP-9表達(dá) (×200)Figure 3 Expression of MMP-9 in aortic AS plaque area in three groups (immunohistochemical staining，×200)

表1三組間動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)陽(yáng)性面積比(±s，%)Table 1MMP-9 positive area ratio in aortic AS plaque area(±s，%)

表1三組間動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)陽(yáng)性面積比(±s，%)Table 1MMP-9 positive area ratio in aortic AS plaque area(±s，%)

與正常對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01;與高膽固醇飲食組比較，#P＜0.05

組別 n 粥樣斑塊MMP-9表達(dá)陽(yáng)性面積比正常對(duì)照組12 0.00 ±0.00高膽固醇飲食組 12 49.17 ±9.12＊＊高膽固醇飲食加吡格列酮組 12 39.17 ±3.52＊＊#

3 討論

研究表明，MMP-9在不穩(wěn)定斑塊中特別是易發(fā)生破裂的斑塊肩部區(qū)域含量較高，酶活性明顯增高，是造成不穩(wěn)定斑塊破裂的主要因素［10，11］。MMP-9是很多生理過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，病理情況下MMP-9被激活，其表達(dá)上調(diào)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展及破裂中發(fā)揮重要作用，這主要通過(guò)血管中膜平滑肌細(xì)胞遷移、增殖、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑實(shí)現(xiàn)的。

大量的實(shí)驗(yàn)表明，PPAR-γ及其配體在巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，具有直接的血管效應(yīng)，激活后可直接在血管壁水平拮抗上述病理作用。吡格列酮是人工合成特異性PPAR-γ激動(dòng)劑，也是臨床上用于治療2型糖尿病的口服降糖藥，近年來(lái)的研究表明，吡格列酮抗動(dòng)脈粥樣硬化的直接效應(yīng)包括增加一氧化氮的生物利用度，減少白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，減少血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖及巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流［12］。此外，PPAR-γ激活后也可通過(guò)脂肪組織間接調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

相關(guān)研究證實(shí)，吡格列酮可劑量依賴性抑制單核細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞MMP-9的mRNA及其蛋白的表達(dá)和活性［13］;羅格列酮對(duì)糖尿病合并冠心病患者的血漿MMP-9水平有明顯降低作用［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常新西蘭兔進(jìn)食高膽固醇飼料后，主動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)陽(yáng)性面積比明顯升高，高膽固醇飲食加吡咯列酮組粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)陽(yáng)性面積少于高膽固醇飲食組。即預(yù)防性服用吡格列酮可在一定程度上使主動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)陽(yáng)性面積水平下調(diào)。這與目前的相關(guān)報(bào)道一致，隨著對(duì)AS發(fā)病機(jī)制分子水平研究的不斷深入，有關(guān)吡格列酮對(duì)MMP-9的影響及在抗AS中的作用將成為新的研究熱點(diǎn)。

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