C75對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制

王益東，陳昆侖，朱海濤，劉仲偉，劉 妮，徐 心(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通外科，西安70004;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;通訊作者，E-mail:xuxin77@6.com)

肝癌在亞洲和非洲發(fā)病率較高，同時由于缺乏針對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的有效治療手段，病死率居高不下［1，2］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因、多因素共同調(diào)控的復(fù)雜過程，其中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑等多種因素在其中發(fā)揮重要作用［3］，但具體機(jī)制尚未完全明了，有待進(jìn)一步深入研究。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，在多種腫瘤中均存在FAS異常高表達(dá)和內(nèi)生性脂肪酸的活躍代謝，包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等［4－9］。FAS與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，許多研究便以其為靶點(diǎn)研發(fā)抗腫瘤藥物，C75便是多種FAS抑制劑中的一種。C75是一種化學(xué)合成的穩(wěn)定的FAS抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)該藥能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［10－17］。但關(guān)于其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用鮮有報(bào)道。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，以利于腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲［3］。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)能夠與抑制MMP的活性，從而對腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用［3］。本研究中，我們對C75對肝癌MHCC97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用做了研究，擬初步闡明C75在肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MMP-2，MMP-9，TIMP-1 和 TIMP-2 蛋白抗體(Cell Signal，美國)，β-actin 單抗(santa cruz，美國)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce，美國)，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone，美國)，C75(SIGMA，美國)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及C75對MHCC97H細(xì)胞增殖能力的檢測 MHCC97H細(xì)胞(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊成成博士饋贈)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃常規(guī)培養(yǎng)。融合率達(dá)到70%－80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。MTT法檢測不同濃度 C75(0，2.5，5，10，20 μg/ml)對 MHCC97H 細(xì)胞增殖能力的影響。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測C75對細(xì)胞遷徙能力的影響接種MHCC97H細(xì)胞于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%－80%時，采用1 μl白槍頭在六孔板中平行劃痕，PBS沖洗脫落細(xì)胞，鏡下觀察劃痕是否良好，細(xì)胞分為空白對照組(DMSO)、2.5 μg/ml和 5 μg/ml組。分別于 0，6，12，24 h 時對劃痕進(jìn)行照相，并對劃痕圖片進(jìn)行分析，檢測C75對細(xì)胞遷徙能力的影響。

1.2.3 Transwell小室法檢測細(xì)胞的侵襲能力 將基質(zhì)膠均勻涂于 Transwell小室(BD，美國)底部。取對數(shù)生長期MHCC97H細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，上室中加入1×105個細(xì)胞(體積200 μl)，下室中加入 500 μl血清濃度為 10% 的完全培養(yǎng)基。分組情況同1.2.2，24 h后取出小室，并進(jìn)行清洗(PBS)，固定(4%多聚甲醛)，染色(結(jié)晶紫溶液)和計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前用棉簽輕輕擦掉上室中未穿過細(xì)胞。

1.2.4 Western blot檢測 MMP-2，MMP-9，TIMP-1 和TIMP-2的蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期MHCC97H細(xì)胞，蛋白裂解液冰上裂解30 min，14 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測蛋白濃度后煮沸變性(5 min)。SDS-PAGE電泳法電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后將膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(MMP-2 1∶1 000、MMP-9 1∶1 000、TIMP-1 1∶1 000、TIMP-2 1∶1 000、βactin 1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST充分洗膜，相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，凝膠成像分析儀采集圖像。

1.2.5 明膠酶譜法檢測蛋白酶活性 利用細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整上樣量，利用0.1% 明膠(gelatin)－8%SDS-PAGE進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后利用2.5%Triton X-100室溫下對膠進(jìn)行洗滌兩次，每次30 min。然后在反應(yīng)液中(10 mmol/L CaCl2，40 mmol/L Tris-HCl，0.01%NaN3，pH8.0)37 ℃孵育12 h。然后利用考馬斯亮藍(lán)對膠進(jìn)行染色并照相，最后對結(jié)果利用Image J進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C75對肝癌細(xì)胞增殖的影響

本研究發(fā)現(xiàn)C75能夠抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖，在濃度低于10 μg/ml時，C75對MHCC97H細(xì)胞的抑制作用并不明顯。為了排除C75抑制MHCC97H細(xì)胞增殖作用對侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們選擇低于10 μg/ml的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。從圖1可以看出在C75濃度低于10 μg/ml時，C75對MHCC97H細(xì)胞的抑制作用并不明顯;在濃度高于10 μg/ml時，能夠明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 C75對MHCC97H細(xì)胞增殖的影響Figure 1 The anti-proliferative effect of C75 on MHCC97H cells

2.2 C75對MHCC97H細(xì)胞遷徙能力的影響

C75能夠明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的遷徙能力，從圖2中可以看出，MHCC97H細(xì)胞的遷徙能力較強(qiáng)，24 h后劃痕基本愈合。但2.5和5 μg/ml C75能夠明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的遷徙能力。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，C75能夠明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這種作用具有明顯的量效關(guān)系(圖3)。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度C75 作用下MHCC97H 細(xì)胞遷徙能力的變化Figure 2 The changes of MHCC97H cell after treatment with C75 for different time by wound healing assa

2.3 C75對MHCC97H細(xì)胞侵襲能力的影響

從圖4中可以看出，隨著C75濃度的增加，MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱，穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，C75能夠明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5)。

2.4 C75 對 MHCC97H 細(xì)胞中 MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2表達(dá)及酶活性的影響

圖3 不同濃度C75對MHCC97H細(xì)胞遷徙能力的影響Figure 3 Effect of C75 on MHCC97H cell migration

圖4 Transwell小室法檢測不同濃度C75作用下MHCC97H細(xì)胞侵襲的能力Figure 4 Changes of the invasion of MHCC97H cells after treated by different concentrations of C75 by Transwell

本研究發(fā)現(xiàn)隨著 C75濃度的增加，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯升高。同時隨著C75濃度的增加，培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9的酶活性也明顯升高，其分解明膠的能力增強(qiáng)。同時MHCC97H細(xì)胞中TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)水平隨著C75濃度的增加，表達(dá)量逐漸升高(見圖 6，7)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些作用具有明顯的量效關(guān)系(見圖6，7)。

圖5 不同濃度C75對MHCC97H細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 5 Effect of C75 on the invasion of MHCC97H cells

圖6 不同濃度C75對MHCC97H細(xì)胞中MMPs及TIMPs蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of C75 on the expression of MMPs and TIMPs in MHCC97H cells

圖7 不同濃度C75對MHCC97H細(xì)胞中MMPs酶活性的影響Figure 7 Effect of C75 on the proteinase activities of MMPs in MHCC97H cells

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS抑制劑C75對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明確的抑制作用，并認(rèn)為FAS極有可能會成為新的抗腫瘤治療靶標(biāo)［10-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，在濃度大于10 μg/ml時，C75能夠抑制肝癌細(xì)胞 MHCC97H的增殖，這與先前研究結(jié)果相似［8］。由于對藥物抗侵襲能力的研究多在其無明顯抗增殖作用的劑量下進(jìn)行，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在低于此濃度的范圍內(nèi)進(jìn)行。

肝癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移又缺乏有效的治療手段，所以肝癌的發(fā)病率和死亡率均較高 。目前，治療肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的目的就是探討C75對肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。細(xì)胞選用了具有高侵襲轉(zhuǎn)移能力的MHCC97H細(xì)胞［7］。對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的體外檢測實(shí)驗(yàn)多采取劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室。本研究也采用了這兩種檢測方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無C75干預(yù)的情況下，MHCC97H細(xì)胞的遷徙和侵襲能力均較強(qiáng)。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，24 h后的劃痕基本愈合，Transwell小室中細(xì)胞穿過的數(shù)目也較多。但經(jīng)C75干預(yù)后，MHCC97H細(xì)胞的遷徙能力和侵襲能力均明顯下降(圖2，3)。說明C75能夠抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

MMP及其抑制劑TIMP在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。MMP能夠降解細(xì)胞外間質(zhì)，以利于腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲［3］。腫瘤細(xì)胞通過增加MMP的表達(dá)及其活性，并降低TIMP的活性，使得腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)的侵襲能力［18］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中MMP濃度升高，且TIMP的濃度降低，這也預(yù)示著MMP/TIMP平衡與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)［19］。為了探討C75抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們檢測了C75對肝癌細(xì)胞中MMP的表達(dá)和活性，以及TIMP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，C75能夠抑制MHCC97H中MMP的表達(dá)和活性，同時促進(jìn)TIMP的表達(dá)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)C75能夠抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這種作用與其對MMP/TIMP平衡的調(diào)節(jié)相關(guān)。

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