慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞的變化及其意義

王 萍，胥 冰，張麗君(陜西中醫(yī)學(xué)院免疫教研室，咸陽(yáng) 712046;通訊作者，E－mai:smilewangwangping@163.com)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染機(jī)體后所引起的肝臟急慢性炎癥，目前全世界大約有2億HCV感染者，且80%為慢性丙型肝炎患者，易進(jìn)展為肝硬化和肝癌，嚴(yán)重危害人民身體健康。慢性丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，確切機(jī)制尚未完全清楚。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的具有特異細(xì)胞膜表面分子和核轉(zhuǎn)錄因子的CD4+T細(xì)胞亞群，在腫瘤、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病及感染性疾病中發(fā)揮重要作用［1］。最近有研究顯示Th17細(xì)胞及效應(yīng)因子IL－17可能在HCV感染過(guò)程中發(fā)揮一定的作用［2－5］。為了進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞在慢性丙型肝炎中的作用，本研究檢測(cè)慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞、核轉(zhuǎn)錄因子視黃醇類(lèi)孤核受體 γt(retinoid－related orphan receptor gamma－t，RORγt)mRNA 及白細(xì)胞介素 17(interleukin 17，IL－17)的水平，并初步探討其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)選擇2012－06～2013－03在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科治療的慢性丙型肝炎患者60例，其中男性36例，女性24例，年齡20－63歲，平均年齡(37.19±14.07)歲。所有病例診斷符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》［6］，均排除其他病毒性疾病、自身免疫性、腫瘤和藥物及酒精性肝炎等，采集樣本前均未進(jìn)行抗病毒治療和免疫調(diào)節(jié)治療。選擇健康體檢者40例作為對(duì)照組，其中男性22例，女性18例，年齡20－62歲，平均年齡(35.67±12.39)歲，均排除病毒性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和藥物及酒精性肝炎。兩組研究對(duì)象性別、年齡的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(性別:χ2=0.246，P=0.619;年齡:t=0.554，P=0.580)。本研究征得了陜西中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)及所有受試者的同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 佛波酯、離子霉素、莫能霉素、固定液、破膜液、FITC－CD4抗體及 Alexa Fluor? 647－IL－17抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，TRIzol液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，cDNA 第一鏈合成劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)體系購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.2.2 Th17細(xì)胞檢測(cè) 患者于清晨空腹抽取靜脈血5 ml，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，取3 ml單細(xì)胞懸液(1 ×106個(gè)/ml)加入佛波酯(50 ng/ml)3 μl、離子霉素(500 ng/ml)1.5 μl，混勻后 37 ℃、5%CO2孵育1 h后加入莫能霉素(蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑)2 μl，37℃、5%CO2孵育4 h，離心洗滌細(xì)胞后加入20 μl FITC－CD4抗體，混勻后避光孵育20 min;洗滌離心后分別加入4℃ 1×固定液、37℃ 1×破膜液后洗滌重懸細(xì)胞后，加入 20 μl Alexa Fluor?647－IL－17 抗體、同型對(duì)照抗體，孵育30 min后洗滌重懸細(xì)胞。利用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Cellquest軟件進(jìn)行收集分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 RORγt mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 500 μl單細(xì)胞懸液加入500 μl TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，利用Fermentas試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成。根據(jù)Genbank RORγt、GAPDH 序列利用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，具體序列如下:RORγt上游引物5’－GAGCCAAGGCTCAGTCATGAGAA－3’，下游引物5’－GTCCCTCTGCTTCTTGGACAT－3’，產(chǎn)物大小 289 bp;GAPDH 上游引物5’－GAGAAGGCTGGGGCTCATTT－3’，下游引物5’－AGTGATGGCATGGACTGTGG－3’，產(chǎn)物大小231 bp。利用20 μl體系進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增:SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μl、PCR 上下游引物(2 μmol/L)各2 μl、cDNA 6 μl。采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃ 10 s預(yù)變性，然后進(jìn)行如下循環(huán):95℃ 5 s，61℃ 15 s，72℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后采用Bio－Rad iQ520 Standard E－dition Optical System Software V2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 血漿中 IL－17水平檢測(cè) 利用 ELISA試劑盒檢測(cè)血漿IL－17水平，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，IL－17的最低檢測(cè)值小于4 pg/ml，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料采用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象外周血Th17細(xì)胞百分率的比較

流式細(xì)胞分析(以CD4+細(xì)胞為門(mén))結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組［(0.87±0.16)%］相比，慢性丙型肝炎患者外周血Th17細(xì)胞百分率［(1.15±0.21)%］明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.157，P=0.000，見(jiàn)圖1)。

圖1 兩組研究對(duì)象外周血Th17細(xì)胞百分率的比較Figure 1 Comparison of the percentage of Th17 cells in the peripheral blood between patients with chronic hepatitis C and healthy controls

2.2 兩組研究對(duì)象外周血RORγt mRNA表達(dá)水平的比較

熒光定量PCR結(jié)果顯示:慢性丙型肝炎患者外周血RORγt mRNA 表達(dá)水平(0.43 ±0.11)明顯高于正常對(duì)照組(0.32±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.257，P=0.000)。

2.3 兩組研究對(duì)象血漿中IL－17水平的比較

慢性丙型肝炎患者血漿IL－17水平明顯升高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(39.43±12.61)pg/mlvs(24.07 ±8.62)pg/ml，t=6.722，P=0.000］。

3 討論

慢性丙型肝炎發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，有研究提示，Th細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡參與了慢性 HCV 感染的發(fā)生、發(fā)展［7，8］。研究表明，慢性丙型肝炎患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多，抑制活性增強(qiáng)，HCV特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)減低，導(dǎo)致HCV持續(xù)感染 。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)CD4 T細(xì)胞亞群，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)源于同一前體細(xì)胞，且二者在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)化，研究證實(shí)Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病、腫瘤及感染性疾病中發(fā)揮重要作用［1］。近期研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在乙型肝炎感染中發(fā)揮一定作用，并與乙型肝炎慢性化及肝功能損傷有關(guān)［11－13］。

迄今為止Th17細(xì)胞在HCV發(fā)病中作用的研究甚少，且研究結(jié)果并不一致［3－5，14］，為了進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞在慢性丙型肝炎發(fā)病中的具體作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了慢性丙型肝炎外周血中Th17細(xì)胞及其主要效應(yīng)分子IL－17的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞百分率及血漿中IL－17水平均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，這與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)果一致［2－5］。但 Foster 等［14］研究發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者肝組織內(nèi)IL－17水平明顯升高，但外周血中IL－17水平與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與研究病例的選擇、采樣時(shí)間、Th17細(xì)胞檢測(cè)手段不同等因素有關(guān)。RORγt是視黃醇家族成員之一，研究表明RORγt是Th17細(xì)胞分化過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子［15，16］，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者RORγt mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，這與Th17細(xì)胞變化一致。有關(guān)HCV感染后Th17細(xì)胞增多的機(jī)制尚未清楚，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白及NS3蛋白可以促進(jìn)Th17細(xì)胞分化［17］，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子可以抑制HCV特異Th17細(xì)胞分化［18］。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者體內(nèi)Th17細(xì)胞百分率增加，分泌IL－17能力增強(qiáng)，可能參與了慢性丙型肝炎的發(fā)病過(guò)程，但本研究?jī)H對(duì)外周Th17細(xì)胞進(jìn)行了研究，如能同時(shí)對(duì)肝內(nèi)Th17細(xì)胞進(jìn)行研究將有助于全面了解Th17細(xì)胞在慢性丙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用，可能為闡明丙型肝炎的慢性化機(jī)制及指導(dǎo)其治療提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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