去乙?；?在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

丁 瑜，付雪瓊，余長(zhǎng)壽，楊 兵(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院消化內(nèi)科，深圳 586;遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū);通訊作者，E-mail:yangbing6708@63.com)

研究發(fā)現(xiàn)主要的致癌信號(hào)通路最后都會(huì)匯聚到腫瘤細(xì)胞代謝上來(lái)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的代謝決定著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，細(xì)胞代謝的改變可作為腫瘤的一個(gè)重要特點(diǎn)［1，2］。很多研究表明，去乙?；?(SIRT3)在腫瘤細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用［3］。SIRT3是沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶家族(sirtiuns)的一員，顯著分布于細(xì)胞線粒體中，通過調(diào)控細(xì)胞葡萄糖的代謝，影響腫瘤細(xì)胞的新陳代謝，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［4］。但SIRT3的表達(dá)與胃癌的關(guān)系尚不清楚，本研究采用Western blot和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中SIRT3的表達(dá)情況，并探討其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集深圳龍崗中心醫(yī)院及深圳市人民醫(yī)院2012－07～2012－12手術(shù)切除且病理資料完整的20例胃癌組織及癌旁組織(距手術(shù)切緣2－5 cm處正常胃組織)標(biāo)本，所取組織置于液氮中保存24 h，后轉(zhuǎn)－80℃冰箱保存，采用Western blot方法檢測(cè)以上20例組織中SIRT3的表達(dá)。另外收集深圳龍崗中心醫(yī)院2006－03～2007－12手術(shù)切除后的胃癌蠟塊包埋標(biāo)本30例，切緣組織為癌旁正常對(duì)照組，采用免疫組化方法檢測(cè)以上50例標(biāo)本中SIRT3的表達(dá)，并分析其與胃癌病理特征的關(guān)系。所有標(biāo)本術(shù)前均未行放化療，且病理診斷明確為胃癌。免疫組化標(biāo)本中男42例，女8例;年齡 30－82歲，平均年齡(60.9±12.3)歲;按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(UICC/AJCC，2010)胃癌 TNM 分期:Ⅰ－Ⅱ期 22例，Ⅲ－Ⅳ期28例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例;高、中分化胃癌24例，低分化胃癌26例。

1.2 材料

SIRT3兔抗人單克隆抗體、鼠抗人單克隆β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 Western blot 取保存于－80℃冰箱的組織樣本，用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度后加入上樣緩沖液，100℃煮沸5－10 min變性，12.5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔上樣總蛋白約30 μg左右，后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入SIRT3及β-actin抗體，用5%BSA稀釋，稀釋比例均為1∶1 000，4℃搖床過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1 h，運(yùn)用ECL試劑盒(Milipore公司)發(fā)光、顯影、定影、沖洗晾干、拍照并成像分析。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 采用免疫組化Max Vision二步法，具體步驟嚴(yán)格按免疫組化化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作，DAB染色，蘇木素復(fù)染后中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，已證實(shí)的SIRT3染色陽(yáng)性的切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定

1.4.1 Western blot結(jié)果判斷 運(yùn)用 Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值，將SIRT3/β-actin的比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.4.2 免疫組化結(jié)果判斷［5］所有切片采用雙盲法由2－3位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師閱片。SIRT3染色陽(yáng)性表達(dá)位于胞質(zhì)內(nèi)，呈清晰棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)顯色細(xì)胞數(shù)和顯色強(qiáng)度兩個(gè)方面來(lái)評(píng)估。按顯色細(xì)胞數(shù)評(píng)分:未見顯色細(xì)胞為0分;細(xì)胞顯色比例＜50%為1分;細(xì)胞顯色比例≥50% 為2分。按顯色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)細(xì)胞顯色為0分，呈淡黃色為1分，呈棕黃色為2分。兩者積分乘積＜2分表示陰性，≥2分表示陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)Western blot檢測(cè)的蛋白相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用t檢驗(yàn)，免疫組化測(cè)定結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)SIRT3在胃癌組織中的表達(dá)

免疫印跡法結(jié)果顯示，SIRT3在胃癌中表達(dá)陽(yáng)性率為35%，其在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常胃組織，SIRT3在胃癌中的表達(dá)水平(0.960±0.126)較胃癌癌旁組織的表達(dá)水平(1.932 ±0.130)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)SIRT3在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues by Western blot

2.2 免疫組化檢測(cè)SIRT3在胃癌組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，SIRT3在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖2)，并且在胃癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為34%，明顯低于癌旁正常胃組織(64%，P＜0.05，見表1)。

圖2 SIRT3在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá) (Max Vision法，×200)Figure 2 The expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues by immunochemistry(Max Vision，×200)

表1 SIRT3在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá) (例)Table 1 Expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues (cases)

2.3 SIRT3的表達(dá)與臨床各病理特征的關(guān)系

SIRT3在胃癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)，但與浸潤(rùn)深度、分化程度及TNM分期有關(guān)(P＜0.05，見表2)。

3 討論

SIRT3是沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶家族(sirtiuns)成員之一，sirtiuns家族被認(rèn)為是Ⅲ類組織蛋白去乙?；?HDAC)，該家族蛋白在進(jìn)化上高度保守，已經(jīng)成為對(duì)衰老和長(zhǎng)壽有重要作用的調(diào)控因子，它們通過NAD+依賴的酶催化活性，在細(xì)胞代謝、抗逆性、細(xì)胞增殖、存活和凋亡等過程起重要作用［6］。SIRT3是線粒體中主要的去乙?；福哂腥ヒ阴；富钚?，定位在11號(hào)染色體(11p15.5)，基因長(zhǎng)度21 kb，在肌肉、肝臟、心臟和褐色脂肪組織等代謝活動(dòng)活躍的組織中高表達(dá)［7］。研究表明，腫瘤細(xì)胞主要通過葡萄糖的有氧糖酵解為細(xì)胞增殖、分化提供能量［4］，而SIRT3正是以新陳代謝的許多酶類作為發(fā)揮去乙酰化作用的靶點(diǎn)，進(jìn)而激活有氧代謝路徑，影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝［6］。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，SIRT3通過多種細(xì)胞代謝通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)，發(fā)揮腫瘤抑制的作用［8，9］。

表2 胃癌SIRT3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 (例)Table 2 The relationship between clinical pathological features of gastric carcinoma and the expression of SIRT3 (cases)

我們的研究結(jié)果顯示，胃癌組織中SIRT3表達(dá)的陽(yáng)性率明顯低于癌旁正常組織，SIRT3在胃癌組織中呈低水平表達(dá)。雖然SIRT3在胃癌組織中低表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，但已有研究［8，10］發(fā)現(xiàn)，SIRT3 在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、睪丸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)也明顯降低。最近Zhang等［11］也通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3在原發(fā)性肝癌組織中低表達(dá)，并且SIRT3的過度表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，以上文獻(xiàn)研究結(jié)果均與我們的研究結(jié)論一致。

同時(shí)Zhang等還發(fā)現(xiàn)SIRT3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與患者的AFP值、腫瘤多發(fā)性、分化程度、臨床分期以及有無(wú)復(fù)發(fā)呈顯著相關(guān)性。為進(jìn)一步探討SIRT3在胃癌的發(fā)展進(jìn)程中的作用，我們分析了SIRT3的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期有關(guān)，浸潤(rùn)胃組織越深，SIRT3的表達(dá)越低;分化程度高較分化程度低的胃癌組織中，SIRT3的表達(dá)水平較高;臨床分期越晚，SIRT3的表達(dá)水平越低，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。提示SIRT3的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的侵襲能力、惡性程度有相關(guān)性，可能為臨床上檢測(cè)SIRT3的表達(dá)水平評(píng)估胃癌的惡性程度提供一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，SIRT3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，SIRT3在胃癌發(fā)生、發(fā)展方面可能發(fā)揮重要作用，SIRT3的表達(dá)與分化程度、浸潤(rùn)深度、臨床分期有相關(guān)性，檢測(cè)SIRT3蛋白的表達(dá)水平可能作為評(píng)估胃癌惡性程度的的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

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