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    PIK3CA在胃癌病變中表達(dá)的研究*

    2013-12-03 03:50:44馬菲菲張慶瑜康春生蔡鳳英宋小妹
    天津醫(yī)藥 2013年11期
    關(guān)鍵詞:胃癌

    馬菲菲 張慶瑜 王 濤 康春生 徐 蓉 蔡鳳英 宋小妹

    磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(PIK3CA)基因位于3號(hào)染色體長臂26號(hào)位點(diǎn)3區(qū),全長34 kb,編碼IA型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的p110α催化亞基,即PI3Kp110α蛋白。目前普遍認(rèn)為PIK3CA的突變?cè)诜伟1]、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸癌[2]等多種實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但有研究證實(shí),PIK3CA基因突變?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展過程中的作用不明顯[3],胃癌中PIK3CA表達(dá)是否增強(qiáng),與腫瘤病理分型存在何種關(guān)系,在PI3K/Akt信號(hào)通路中起到何種作用尚不清楚[4]。本研究采用組織芯片和免疫組織化學(xué)技術(shù),檢測和分析了不同病理級(jí)別胃腺癌、癌旁組織和正常胃黏膜中的PIK3CA及IA型PI3K/Akt通路主要成員絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(pAkt)、細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原(ki-67)的表達(dá)及相互關(guān)系,旨在探討其在腫瘤增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料 (1)組織芯片。組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司,包含胃腺癌及其匹配癌旁組織與正常胃黏膜組織組合微陣列,其中45例腺癌及其匹配的癌旁組織每例2點(diǎn),10例正常組織每例1點(diǎn)。點(diǎn)數(shù)100,10×10排列,直徑1 mm,厚度5 μm。在45例腫瘤樣本中男33例,女12例,年齡30~78歲,中位年齡59歲,其中低分化腺癌8例,中分化腺癌28例,高分化腺癌9例;10例正常組織樣本中男9例,女1例,年齡16~50歲,中位年齡37歲。芯片的每個(gè)點(diǎn)樣均經(jīng)過病理診斷。(2)試劑。鼠抗人PIK3CA單克隆抗體購自Abnova公司、兔抗人pAkt(1∶100)多克隆抗體、鼠抗人ki-67(1∶100)單克隆抗體購自Santa Cruz公司,山羊抗兔HRP二抗、馬抗小鼠HRP二抗、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫組織化學(xué) 組織芯片脫蠟至水,消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,抗原修復(fù)、室溫孵育后,依次加1∶100稀釋的一抗,棄一抗,0.01 mol/L PBS(pH7.2~7.4)沖洗,3 min,連續(xù)3次,加1∶100稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育30 min,滴加1∶100稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37 ℃孵育30 min,PBS沖洗,5 min,連續(xù)3次。常規(guī)脫水,透明、樹脂封片,顯微鏡觀察、拍照。以上免疫染色以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。

    1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 PIK3CA、pAkt胞漿胞核出現(xiàn)DAB著色為陽性表達(dá),ki-67只有細(xì)胞核著色時(shí)視為陽性表達(dá),用裝有目鏡網(wǎng)格微測尺的200倍視野計(jì)數(shù)8個(gè)網(wǎng)格中的PIK3CA、pAkt、ki-67蛋白表達(dá)陽性和陰性的腫瘤細(xì)胞數(shù),按各種蛋白陽性腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比,將其分為4個(gè)等級(jí):無陽性細(xì)胞為-,陽性細(xì)胞lt;30%為+,陽性細(xì)胞30%~60%為++,陽性細(xì)胞gt;60%為+++。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,各組間差異比較采用R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn),蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 胃腺癌、癌旁組織、正常胃黏膜組織中PIK3CA、pAkt、ki-67的表達(dá) 胃腺癌組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色以+++為主,呈彌漫的棕黃色或棕褐色染色,相應(yīng)的癌旁組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色以++~+++為主,呈小灶或彌漫的棕黃色或棕褐色染色,正常胃黏膜組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色陽性者均為+,點(diǎn)狀棕黃色或棕褐色染色,見圖1~3。PIK3CA、pAkt、ki-67在胃癌及其癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1。3種組織中PIK3CA與pAkt、ki-67表達(dá)均呈正相關(guān)(rs分別為0.916、0.945,均Plt;0.01),ki-67、pAkt表達(dá)亦呈正相關(guān)(rs=0.890,Plt;0.01)。

    Table 1 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in gastric carcinoma and adjacent tissues and normal gastric tissues表1 PIK3CA、pAkt和ki-67在胃癌及其癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)

    2.2 不同病理級(jí)別胃腺癌中PIK3CA、pAkt、ki-67的表達(dá)情況 PIK3CA、pAkt、ki-67在低分化腺癌黏膜組織中染色以++~+++為主,呈彌漫的棕黃色或棕褐色染色,在中分化腺癌黏膜組織中染色以+~+++為主,呈小灶或彌漫的棕黃色或棕褐色染色,在高分化腺癌黏膜組織中染色多數(shù)為陰性,見圖1~3。PIK3CA、pAkt、ki-67在不同病理級(jí)別胃癌中表達(dá)的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05),見表2。胃腺癌組織中PIK3CA與pAkt、ki-67表達(dá)均呈正相關(guān)(rs分別為0.885、0.934,均Plt;0.01),ki-67、pAkt表達(dá)亦呈正相關(guān)(rs=0.833,Plt;0.01)。

    Table 2 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in different pathological grades of gastric carcinoma表2 PIK3CA、pAkt和ki-67在不同病理級(jí)別胃癌中的表達(dá)

    3 討論

    3.1 胃癌組織中PIK3CA表達(dá)與腫瘤發(fā)病的關(guān)系 本研究中PIK3CA在胃癌及其癌旁組織的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組織,提示PIK3CA的過度表達(dá)在胃癌的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。PIK3CA與pAkt在不同病理組織中表達(dá)的正相關(guān),則進(jìn)一步說明PIK3CA表達(dá)水平對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路活性存在影響,以往研究表明PIK3CA編碼PI3K的催化亞基p110α,是PI3K/Akt信號(hào)通路中重要組成部分[5],由此推斷胃腫瘤組織中PIK3CA表達(dá)水平上調(diào)導(dǎo)致PI3Kp110α的催化活性增強(qiáng),促使Akt磷酸化,進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑,促進(jìn)了胃腫瘤的發(fā)病。另外,ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原[6],與細(xì)胞周期密切相關(guān),能較好地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性。本研究中PIK3CA與ki-67在不同病理組織中表達(dá)的正相關(guān),提示PIK3CA表達(dá)水平上調(diào)可能間接地促進(jìn)了胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖。

    3.2 胃癌組織中PIK3CA表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系 本研究顯示不同病理級(jí)別的胃腺癌組織中PIK3CA表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明PIK3CA高表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度存在關(guān)聯(lián),越來越多的研究證明,PI3K/Akt信號(hào)通路中pAkt在調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程過程中起了重要作用,如細(xì)胞生長和增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲,其機(jī)制可能為Akt的持續(xù)性表達(dá)能誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變,賦予了組織侵襲和轉(zhuǎn)移所需的運(yùn)動(dòng)性[7]。本研究中PIK3CA與pAkt的表達(dá)在不同病理分級(jí)的胃腫瘤組織中呈正相關(guān),且PIK3CA、pAkt蛋白的表達(dá)陽性程度隨胃腺癌的惡性程度的增高而增高,由此推測PIK3CA在胃腫瘤的增殖與分化中發(fā)揮了重要作用,其表達(dá)上調(diào)使其下游靶向分子Akt過度激活,進(jìn)而產(chǎn)生一系列生物學(xué)行為。除此之外,本研究中,ki-67的表達(dá)也與PIK3CA、pAkt者之間存在正相關(guān)關(guān)系,說明在胃癌的發(fā)病中PIK3CA與腫瘤的增殖密切相關(guān),其機(jī)制可能是PIK3CA作為PI3K/Akt信號(hào)通路的始動(dòng)因子,促使Akt磷酸化,進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑,促進(jìn)胃癌增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測這3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)程度,將進(jìn)一步提高胃腫瘤的早期診斷率,估計(jì)患者預(yù)后,指導(dǎo)治療。

    Figure 1 Expressions of PIK3CA in different gastric tissues(Envision method×200)圖1 PIK3CA在不同組織中的表達(dá)(Envision法×200)

    Figure 3 Expressions of ki-67 in different gastric tissues(Envision method×200)圖3 ki-67在不同組織中的表達(dá)(Envision法×200)

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