新型食物不耐受sIgG定量檢測方法的構(gòu)建*

相 平 孫 靜 周宇捷 任 杰 劉堂喻哼 李會強△

近年來，食物不耐受現(xiàn)象越來越普遍，已成為國內(nèi)、外研究的重點[1-2]。食物不耐受的診斷主要依靠病史、雙盲安慰劑對照試驗和體外過敏原特異性免疫球蛋白G（sIgG）檢測[3]。與食物過敏性疾病相比，食物不耐受引起的臨床表現(xiàn)不典型，依靠病史很難做出明確診斷；雙盲安慰劑對照試驗因程序復(fù)雜、耗時長未在國內(nèi)廣泛使用。血清sIgG具有檢測方法簡單、高通量等優(yōu)點，備受臨床重視和歡迎。檢測血清sIgG作為確認不耐受食物的重要依據(jù)，同時監(jiān)測血清sIgG的變化可評價脫敏治療的效果。當前檢測血清sIgG主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）[4-5]。臨床廣泛使用的試劑盒是由美國BIOMERICA公司生產(chǎn)的。此試劑是以14種食物為組合的固定模式，缺乏靈活性，不適于患者個性化檢測，更不適合已確診患者脫敏治療時對單一抗體的動態(tài)監(jiān)測。因雞蛋被認為是引發(fā)食物不耐受反應(yīng)最常見的食物之一[6]，故本研究以雞蛋為例，嘗試利用生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)，建立一種新型的雞蛋不耐受sIgG定量檢測方法，以期為今后研制“個性化”隨機組合食物過敏原sIgG檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2012年10月—2013年7月于天津市人民醫(yī)院行食物過敏原sIgG檢測的門診和住院患者173例。其中，符合臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測試劑盒（美國BIOMERI?CA公司）診斷和分級標準的陽性患者有95例，男40例，女55例，平均年齡（45.22±14.34）歲，其血清sIgG均大于50 U/mL；另擇健康體檢者78例為陰性對照，男29例，女49例，平均年齡（38.66±10.84）歲，其血清sIgG均小于50 U/mL。

1.2 材料及儀器 生物素化牛血清白蛋白（biotinylated bo?vine serum albumin,Bio-BSA，購自Equitech-Bio公司，貨號：BAH67-0050），鏈霉親和素（購自PIERCE公司，貨號：21122），長臂活化生物素（Sulfo-NHS-LC-Biotin，Thermo Piece，貨號：21335），辣根過氧化物酶（HRP）-抗人IgG（購自SouthernBiotech，貨號：6140-05），卵類黏蛋白（Ovomucoid，OVM）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Ovotrans?ferrin，OVT）、溶菌酶（Lysozyme，Ly）均購自美國Sigma公司，貨號分別為T 2011-250 MG、A 5503-1 G、C 0755-100 MG、L 6876-1 G；96孔酶標反應(yīng)板（美國Costar公司）。低溫高速冷凍離心機（BECKMAN COULTER OptimaTML-80 XP）、酶標分析儀（Bio-Tek公司EXL-800型）。

1.3 制備生物素化的食物蛋白 取新鮮雞蛋2枚，分離蛋清和蛋黃，采用丙酮沉淀法制備蛋清提取液[7]。按1∶5的體積比加入-20℃預(yù)冷丙酮，于4℃去脂24 h。然后3 000 r/min離心30 min，將沉淀通風揮干后稱質(zhì)量。按8 mL/g溶于0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）中，于4℃提取24 h。最后離心，收集上清液，即為蛋清粗提液。測定溶液的濃度，分裝后-20℃保存。蛋黃提取液的制備方法與此相同。

雞蛋抗原的生物素標記方法參照文獻[8]并略作調(diào)整。用0.1 mol/L NaHCO3（pH 9.5）溶液配制1 g/L的待偶聯(lián)抗原。用二甲基甲酰胺配制20 g/L的生物素。按一定比例計算生物素的用量，然后將生物素緩慢、逐滴加入待偶聯(lián)抗原溶液中，邊滴加邊攪拌。全加入后室溫攪拌1 h。在4℃下用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）溶液透析24 h，充分除去游離生物素。分裝貯存，4℃放置備用。

1.4 生物素-鏈酶親和素化酶標反應(yīng)板的制備 依據(jù)生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標反應(yīng)板制備方法（專利號：201110068782.9），制備生物素-鏈酶親和素化酶標反應(yīng)板[9]。取聚苯乙烯微孔板每孔加150 μL生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液，室溫過夜。洗板2次，每次10 min。每孔加150 μL鏈霉親和素包被緩沖液，室溫2 h。洗板2次，加入封閉液，4℃過夜。真空干燥后備用。

1.5 生物素化抗原的選擇 隨機抽取10例陰性血清和10例陽性血清，分別混合制備陰性和陽性混合血清。采用本實驗建立的方法測定混合血清中sIgG的含量。每個標本做復(fù)孔，計算其平均值，選擇陽性血清吸光度值（AP）與陰性血清吸光度值（AN）比值最大的生物素化抗原，作為本方法所選用的抗原。

1.6 生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素ELISA方法的建立 取制備的生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標反應(yīng)板1個，每孔加入25 μL待測血清（預(yù)先1∶20倍稀釋），然后加入100 μL生物素抗原，37℃溫育1 h；洗板5次，拍干；加入HRP-抗人IgG 125 μL，37 ℃溫育30 min；再洗板5次，拍干；在反應(yīng)孔中加入底物A、B各1滴，室溫反應(yīng)10 min；在反應(yīng)孔中加終止液1滴，用Bio-Tek EXL-800酶標儀測定在450 nm處的吸光度（A）值。用方陣滴定法，即不同濃度生物素化抗原和HRP-抗人IgG進行組合，以標準曲線擬合及AP/AN最大值作為評價標準，選擇生物素化抗原和HRP-抗人IgG的最佳稀釋度。

1.7 sIgG定量標準曲線的建立 將食物不耐受sIgG的強陽性混合血清稀釋成不同濃度，以臨床現(xiàn)用食物過敏原sIgG檢測試劑盒（美國BIOMERICA公司）檢測，分別以0、50、100、200、400 U/mL作為標準品，用以上得到的最優(yōu)反應(yīng)條件檢測其450 nm處A值，根據(jù)檢測結(jié)果繪制標準曲線。

1.8 方法學(xué)鑒定實驗

1.8.1 精密度 取高、中、低值濃度的血清，在同一次實驗中檢測sIgG的含量，每個樣本平行做10次，計算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）；在不同實驗日檢測高、中、低值樣本中sIgG的含量，每個樣本平行做10次，計算批間CV。

1.8.2 特異性 隨機抽取13例其他食物sIgG陽性、雞蛋sIgG陰性的血清，用標準品稀釋液稀釋，采用本實驗建立的方法測定A值，計算與其他食物sIgG的交叉反應(yīng)情況。

1.8.3 正常參考值上限的確定 選取50例正常人血清，用本實驗方法測定雞蛋sIgG的濃度，計算A值的平均值及標準差，以標準曲線反算出平均值加2倍標準差所對應(yīng)的濃度值即為正常人雞蛋sIgG參考值上限。

1.8.4 與臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測試劑盒的比較 隨機抽取20例臨床標本，分別用本實驗建立的方法和臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測試劑盒測定雞蛋sIgG的含量，采用相關(guān)性分析對2種檢測方法的測定結(jié)果進行比較。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，相關(guān)分析采用直線相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物素化抗原的選擇 生物素化蛋清提取物（Bio-蛋清）的AP/AN值最大（均P＜0.05），A值在酶標儀的檢測范圍內(nèi)，能將陰陽性血清區(qū)分開，因此將Bio-蛋清作為本方法所選用抗原，見表1。

Table 1 The choice of biotin allergens表1 生物素化抗原的選擇 （x±s）

2.2 Bio-蛋清和HRP-抗人IgG最佳工作濃度的確定 Bio-蛋清提取物的最適稀釋比例是1∶2 000，酶標抗體的最適稀釋比例是1∶12 000，此時的AP/AN值最大，見表2。

Table 2 The best concentration of biotinylation egg white and HRP-anti human IgG表2 Bio-蛋清和HRP-抗人IgG最適濃度的方陣滴定結(jié)果

2.3 sIgG定量標準曲線的建立 以sIgG的濃度為橫坐標，以A值為縱坐標，用Logistic曲線擬合（四參數(shù)）繪制標準曲線，其劑量-反應(yīng)曲線見圖1。

Figure 1 Standard curve for specific IgG圖1 血清sIgG標準曲線

2.3 精密度檢測 高、中、低濃度血清的批內(nèi)及批間CV均小于10%，說明本方法具有良好的重復(fù)性，見表3。

Table 3 Within-run and between-run of different serum-concentrations表3 不同濃度血清的批內(nèi)及批間變異

2.4 特異性 與蟹不耐受患者血清的交叉反率為7.61%，與牛、羊奶不耐受患者血清的交叉反應(yīng)率為1.33%，與蘑菇、雞油菌、牛肝菌不耐受患者血清的交叉反應(yīng)率為0.17%。

2.5 正常參考值上限 結(jié)果呈正態(tài)分布，正常人sIgG參考值上限為50 U/mL。

2.6 與臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測試劑盒的比較 以臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測試劑盒的測定值作為橫坐標，以本實驗建立方法的測定值為縱坐標，繪制散點圖，對兩種方法的測定值進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示本實驗建立的方法與臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測法有較好的相關(guān)性，回歸方程為=0.977X+8.45，r=0.961，見圖2。

Figure 2 Linear correlation between biotin-avidin ELISA and current clinical test for sIgG圖2 生物素-親和素ELISA法與臨床現(xiàn)用sIgG檢測法的相關(guān)性

3 討論

食物不耐受的臨床表現(xiàn)主要有腹瀉、皮膚反應(yīng)、頭痛、哮喘等，其與多種慢性病有關(guān)，可累及消化、皮膚、神經(jīng)、心血管等全身多個系統(tǒng)，其中以消化系統(tǒng)最為常見[10]。消化系統(tǒng)疾病尤其是慢性腹瀉、炎癥性腸病、慢性胃炎等出現(xiàn)食物不耐受的比例達93.3%，且同時對2種以上的食物不耐受的比例高達90%[11-12]。有研究表明，蛋清或蛋黃、蟹、牛奶是最主要的常見不耐受食物[13]。然而，由于其具有起病隱匿、涉及食物較多、診斷困難的特點，患者難以自我發(fā)現(xiàn)敏感食物。如不及時治療，這種免疫損傷將會不斷積累，引發(fā)一系列慢性癥狀或疾病，給患者帶來長期困擾。

目前國內(nèi)用于定量測定食物sIgG含量的國產(chǎn)試劑盒較少，主要依賴國外進口。臨床廣泛使用的試劑盒是由美國BIOMERICA公司生產(chǎn)的，此種試劑由廠家預(yù)先將14種食物蛋白包被于微孔板表面，其檢測食物種類的組合模式無法改變，缺乏靈活性，更不適合已確診患者脫敏治療時對單一抗體的動態(tài)監(jiān)測，造成多余的檢測和漏檢，同時會增加檢測成本，不易在基層醫(yī)療機構(gòu)推廣使用。

本文引入生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素-生物素化抗原間接包被ELISA法檢測食物不耐受sIgG。由于鏈霉親和素對生物素具有高度親和力（親和常數(shù)為1×1015/mol），與生物素結(jié)合后形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物，很難解離。因此，可以實現(xiàn)抗原的即時包被。一方面，牛血清白蛋白來源方便、包被方式簡單、穩(wěn)定性好，保留了抗原活性，提高抗原利用效率。另一方面，有研究表明，通過這種間接包被模式可最大限度減少包被抗體的空間位阻效應(yīng)，提高抗體的利用效率，降低實驗成本[14]。這種間接包被的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于多種檢測指標，如妊娠相關(guān)蛋白A、人絨毛膜促性腺激素、抗甲狀腺過氧化物酶抗體[9,15-16]等并取得較好效果。

本實驗以雞蛋為例，利用生物素化牛血清白蛋白-鏈酶親和素-生物素化抗原間接包被模式檢測血清中sIgG濃度。研究顯示，此種新型酶聯(lián)免疫模式具有較好的精密度和特異性。本方法與美國BIO?MERICA公司生產(chǎn)的試劑盒具有較好的相關(guān)性，可用于檢測食物不耐受sIgG含量。食物不耐受涉及的種類繁多，對于其他不耐受食物的新型檢測方法還有待推廣和改進。在試劑盒進一步優(yōu)化和廣泛驗證后，就可以根據(jù)患者需要選擇疑似不耐受食物，實現(xiàn)個性化檢測，相當于從“套餐式”改進為“訂單式”，具有十分重要的意義。了解食物不耐受現(xiàn)象，判斷產(chǎn)生不耐受的食物品種，通過針對性的禁食或少食不耐受食物可以有效地改善癥狀，控制疾病，改善健康狀況，從而避免不耐受食物造成的不良影響，遏制疾病發(fā)生和發(fā)展。

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