人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤骨轉(zhuǎn)移模型的建立及鑒定

趙紅宇，蔡煒嵩，李帥，笪祖科，孫寒雪，馬良，林耀新，智德豹

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.神經(jīng)外科；2.腫瘤科；3.病理科，沈陽110004）

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童和嬰兒期最常見的顱外神經(jīng)內(nèi)分泌性實體腫瘤，占兒童惡性腫瘤的8%～10%，約占兒童腫瘤死亡病例的15%［1，2］。NB 由于具有自發(fā)修復(fù)、轉(zhuǎn)化、侵襲性生長特性而造成預(yù)后不佳［3］。約70%的NB患者出現(xiàn)腫瘤擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，骨、骨髓和肝臟是最常見的轉(zhuǎn)移部位［4］。NB轉(zhuǎn)移患者中骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率可達(dá)56%，影像學(xué)上可見溶骨性表現(xiàn)［4］，常引起疼痛、病理性骨折、高鈣血癥及脊髓壓迫等癥狀［5］。骨轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確［6］。建立理想的動物模型對理解NB細(xì)胞與骨微環(huán)境的相互作用十分重要。本研究擬通過直接注射NB細(xì)胞系（SY5Y，KNCR）細(xì)胞至裸鼠股骨骨髓腔內(nèi)，建立新的NB骨轉(zhuǎn)移模型，模仿NB細(xì)胞與骨微環(huán)境之間的相互作用，觀察NB的骨轉(zhuǎn)移特征，同時檢測多種與骨侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白因子在NB骨轉(zhuǎn)移模型中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SY5Y和KNCR細(xì)胞系購于美國ATCC公司（American Type Culture Collection）。2種細(xì)胞系接種在完全培養(yǎng)液中［含IMDM（Bio Whittaker公司，美國），3 mmol/L L-谷氨酰胺（Gemini Bioproducts公司，美國）；5 μg/mL 胰島素，5 μg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白，5 ng/mL亞 硒 酸 （ITS CultureSupplement；Colaborative Biomedical Products公司，美國），20%熱滅活胎牛血清（Omega Scientific公司，美國）］。使用的2種細(xì)胞系均低于30代，培養(yǎng)于5%CO2/95%空氣的濕潤環(huán)境中，無附加抗生素。2種細(xì)胞系均為支原體檢驗陰性，未進(jìn)行體外耐藥試驗的篩選。

1.2 動物及NB細(xì)胞骨侵襲/轉(zhuǎn)移模型的建立

1.2.1 實驗動物：4～6周齡雌性無胸腺balb/c（nu/nu）裸鼠，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。裸鼠自由飲食水，明/暗每12 h交替光照，溫度、濕度和通風(fēng)符合中國醫(yī)科大學(xué)動物管理條例，同時獲得倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 動物模型的建立：吸入麻醉后，沿裸鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)做10 mm長縱向切口，分離膝部韌帶及肌肉，暴露股骨遠(yuǎn)端。以帶有26號針頭的骨鉆鉆進(jìn)股骨遠(yuǎn)端制成骨孔，將連接有30號針頭的Hamilton10 μL針管沿骨孔插入骨髓腔內(nèi)約3 mm，將2 μL SY5Y或KCNR NB細(xì)胞懸浮液（約2×105個腫瘤細(xì)胞，懸浮于無血清、不含鈣鎂的L-15培養(yǎng)液中）分別注射入10只裸鼠骨髓腔內(nèi)。術(shù)畢后，安置裸鼠于體溫控制箱中至完全蘇醒。研究遵循倫理委員會的指導(dǎo)并得到中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的核準(zhǔn)。

1.3 NB細(xì)胞骨侵襲/轉(zhuǎn)移模型的確定

1.3.1 影像學(xué)檢查：對全部動物每周進(jìn)行1次X線檢查。采用Faxitron MX-20小動物X線裝置（Faxitron X-ray Corp，美國）、乳房攝影專用的計算機(jī)攝影暗盒、高清晰度單面乳膠攝影膠片（Fuji EC-MA cassette，F(xiàn)uji Photo Film Co，日本）。拍照過程中，將動物以合適的體位置于拍攝裝置內(nèi)，保證其尾部包括雙側(cè)下肢包含在拍攝范圍內(nèi)。建立骨病變的影像分級系統(tǒng)進(jìn)行骨侵襲/轉(zhuǎn)移的定量評估：1級：與對側(cè)股骨比較病變肢體為正常骨質(zhì)；2級：局限于股骨遠(yuǎn)端的無癥狀的非進(jìn)展性的可透射線的骨質(zhì)病變，或為與骨髓腔內(nèi)注射相關(guān)的外傷性改變；3級：無癥狀性的溶骨性改變或朝向股骨近端延伸的進(jìn)展性改變；4級：出現(xiàn)病理性骨折或骨皮質(zhì)的斷裂及連續(xù)性的破壞。影像學(xué)結(jié)果由2名獨立的放射科醫(yī)師決定。影像學(xué)上出現(xiàn)4級病變或出現(xiàn)顯著不適時處死裸鼠，記錄該時間作為終末時間點（end point），用以評估腫瘤的進(jìn)展情況及NB細(xì)胞的侵襲能力。

1.3.2 腫瘤細(xì)胞骨侵襲的組織學(xué)分級及評估：1級：未發(fā)現(xiàn)骨及骨髓侵襲；2級：侵襲的腫瘤細(xì)胞僅局限于骨髓腔內(nèi)；3級：腫瘤細(xì)胞已侵襲進(jìn)入骨質(zhì)中，但尚未穿破骨膜；4級：腫瘤細(xì)胞已穿破骨膜，侵襲入軟組織甚至肌肉組織中。所有組織學(xué)切片均由2名獨立的病理醫(yī)生進(jìn)行判斷分級。

1.3.3 免疫組化檢測：10%中性緩沖甲醛溶液固定骨標(biāo)本24 h。10%甲酸脫鈣，石蠟包埋。將標(biāo)本切成5 mm厚，二甲苯脫蠟，梯度乙醇再水合。0.3%過氧化氫中孵化后，磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌。染色檢測骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、NF-κB 受體激活物配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone related protein，PTHrP）、內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1） 和 CXC趨化因子受體 4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）的表達(dá)。為了減少異種組織的非特異性結(jié)合，用各含5%馬、山羊和雞的混合血清封閉樣本1 h。在血清封閉溶液中稀釋初級抗體。用家兔IgG或者免疫前血清代替初級抗體，以相同的方法處理對照載玻片。生物素次級抗家兔抗體作為底物，應(yīng)用ABC試劑盒和DAB進(jìn)行免疫組化染色。蘇木精復(fù)染，應(yīng)用Histomount（Zymed公司，美國）蓋片。樣本中腫瘤細(xì)胞比例>10%者為陽性標(biāo)本。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨侵襲/轉(zhuǎn)移模型的大體及影像學(xué)觀察（圖1，圖2）

X線檢查結(jié)果顯示：裸鼠股骨骨髓腔注入SY5Y或KCNR細(xì)胞4周后，均出現(xiàn)明顯的溶骨性反應(yīng)，表現(xiàn)為病理性骨折或骨皮質(zhì)斷裂及連續(xù)性破壞，且均產(chǎn)生肉眼可見的膨脹性溶骨性病變，并伴有周圍軟組織異常。

2.2 組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察

SY5Y和KCNR NB細(xì)胞在股骨骨髓腔內(nèi)引起溶骨性反應(yīng)，表現(xiàn)為骨皮質(zhì)的破壞以及骨侵襲表面的形成。在被侵襲的股骨中，破骨細(xì)胞大量出現(xiàn)并侵蝕骨質(zhì)，同時未觀察到新生骨的形成。免疫組化結(jié)果表明：在KCNR和SY5Y細(xì)胞接種后形成的腫瘤中，PTHrP、RANKL、OPG、ET-1 均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且PTHrP和RANKL的陽性表達(dá)率顯著高于OPG和ET-1（P<0.001），PTHrP在腫瘤細(xì)胞及骨細(xì)胞中均有陽性表達(dá)。CXCR4在骨轉(zhuǎn)移瘤中不表達(dá)或表達(dá)極弱（圖3）。在骨侵襲生長的微環(huán)境中可以找到成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞（圖4）。

3 討論

NB是嬰幼兒最常見的顱外實體腫瘤［7］，具有高度轉(zhuǎn)移傾向及明顯的異質(zhì)性，包括自我修復(fù)、惡變和侵襲性生長等多種特性，預(yù)后極差［8］。大部分NB患者在診斷時即已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［9］，其中56%發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［10］。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個高度有序的復(fù)雜過程，由多個相互關(guān)聯(lián)的步驟組成，包括：腫瘤細(xì)胞在鄰近組織的局部侵襲，進(jìn)入血循環(huán)進(jìn)行遷移運動，隨后定位于遠(yuǎn)隔的轉(zhuǎn)移部位。骨成為NB腫瘤細(xì)胞的常見轉(zhuǎn)移部位是由于NB細(xì)胞與骨和骨髓的獨特的微環(huán)境之間存在著密切的相互作用。

腫瘤骨轉(zhuǎn)移動物模型有助于研究其機(jī)制。理想的NB骨轉(zhuǎn)移動物模型應(yīng)該能完全模擬人類患病的各個方面。但實踐證明建立一個腫瘤細(xì)胞能自發(fā)轉(zhuǎn)移的動物模型十分困難，在NB細(xì)胞尚未轉(zhuǎn)移到骨組織時，荷瘤動物往往已經(jīng)因腫瘤廣泛播散到身體其他部位而死亡，從而阻礙了骨破壞進(jìn)程的監(jiān)測及NB骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究［11］。本研究通過直接注射NB細(xì)胞至裸鼠的股骨骨髓腔內(nèi)建立了NB骨轉(zhuǎn)移動物模型，并觀察到NB骨轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)以及生化反應(yīng)情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NB細(xì)胞直接注射到裸鼠的股骨骨髓腔內(nèi)后，骨組織增殖同時激發(fā)了溶骨反應(yīng)，影像學(xué)和組織學(xué)檢查均發(fā)現(xiàn)腫瘤侵襲骨質(zhì)的現(xiàn)象，并都產(chǎn)生了肉眼可見的膨脹性溶骨病變以及軟組織病變。這種直接髓腔內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞的方法是人為造成的轉(zhuǎn)移，這種模型不能反映腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件，如遷移和外滲等，這對于研究NB的遷移具有一定的局限性。

研究表明，NB細(xì)胞能夠表達(dá)RANKL，直接刺激破骨細(xì)胞增生。成骨細(xì)胞產(chǎn)生的BDNF刺激PTHrP產(chǎn)生，使得成骨細(xì)胞的RANKL表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞的進(jìn)一步激活和成熟，促進(jìn)溶骨反應(yīng)的發(fā)生。而在RANKL表達(dá)缺失的情況下，NB細(xì)胞則可以與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（BM-MSC）或者腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMO）相互作用，促進(jìn)SDF-1、MMPs和 OAFs（如 IL-6、IL-8 和 MIP-1β）的分泌，同樣可促進(jìn)溶骨反應(yīng)的發(fā)生［12］。為了評價NB骨轉(zhuǎn)移模型中NB細(xì)胞與骨的相互作用，本研究還檢測了多種與溶骨反應(yīng)相關(guān)以及在骨侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮重要作用的蛋白因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：裸鼠骨轉(zhuǎn)移瘤中OPG和RANKL均表達(dá)上調(diào)，PTHrP和ET-1均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而且相對于對側(cè)正常骨組織，這些蛋白的表達(dá)在骨的特殊環(huán)境中均有上調(diào)，與人類NB的行為一致。此外，PTHrP和RANKL的免疫反應(yīng)性明顯高于OPG和ET-1，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：在骨轉(zhuǎn)移瘤中，相對于正常骨組織，骨轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白CXCR4的表達(dá)下調(diào)，且其免疫反應(yīng)性明顯低于其他骨轉(zhuǎn)移相關(guān)因子。以上結(jié)果均提示PTHrP和RANKL在骨侵襲/轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮更為重要的作用，并進(jìn)一步證明CXCR4能促進(jìn)原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤的生長及腫瘤細(xì)胞的遷移，但是不參與腫瘤細(xì)胞的骨侵襲作用［13］。

綜上所述，本研究所建立的裸鼠NB骨轉(zhuǎn)移模型高度類似于人類NB骨轉(zhuǎn)移，將為NB腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑與機(jī)制以及藥物對NB骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制的研究提供有效的動物模型。

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