楊前,高殿文
(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科,遼寧 大連11 6023;2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院眼科,沈陽110004)
腦紅蛋白(neuroglobin,Ngb)是2000年由德國Burmester等首先發(fā)現(xiàn)的一種攜氧球蛋白,是繼血紅蛋白(Hb)和肌紅蛋白(Mb)之后的第三種攜氧球蛋白[1]。主要在腦組織中表達,故命名。Ngb能夠可逆性地結(jié)合氧,與氧有很高的親和力,能夠特異性地向腦組織供氧,在神經(jīng)系統(tǒng)氧的攝取、運輸和利用等生理過程中起極其重要的作用。即使血氧濃度較低,與氧具有很高親和力的Ngb仍將促進氧向線粒體的擴散或直接介導氧向線粒體的傳遞,促進ATP的產(chǎn)生,從而維持正常神經(jīng)元的功能[2]。已有實驗證實,Ngb可以保護神經(jīng)元免受缺血缺氧的損害[3,4]。視覺信息傳導過程中需要消耗大量的氧氣,因此視網(wǎng)膜是人體耗氧量最大的組織之一。視網(wǎng)膜中Ngb的含量是大腦中的100倍,分布于除色素上皮以外的所有視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞內(nèi)[5]。Ngb與氧結(jié)合的特性,以及Ngb在視網(wǎng)膜的特異性分布為我們進行缺血缺氧視網(wǎng)膜疾病的研究帶來了全新的令人振奮的思路和方向。
本研究旨在構(gòu)建以GFP為報告基因的重組表達質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb,并將其轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中,為進一步研究Ngb基因的功能奠定基礎。
健康雄性成年SD大鼠1只,體質(zhì)量210 g,由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。質(zhì)粒pAcGFP1-C1購自美國Clontech公司,大腸桿菌JM109為本室保存。RNAiso Plus、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、DL-2000 Marker,DNA膠回收試劑盒及RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0均購自大連寶生物工程公司。LipofectamineTM2000和DMEM培養(yǎng)液為Invitrogen公司產(chǎn)品,胎牛血清購于Gibico公司,SH-SY5Y細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。引物的合成及DNA測序均由大連寶生物工程公司完成。
1.2.1 Ngb基因的PCR擴增:將SD大鼠斷頭處死,取出適量的腦組織,按照RNAiso Plus說明書提取總RNA,經(jīng)分光光度計檢測其純度及含量。采用兩步法RT-PCR擴增Ngb基因。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系包括:1 μL Total RNA,1 μL Oligo dT Primer,1 μL dNTP Mixture,4 μL5× PrimeScript RT Buffer,0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL),PrimeScript RTase0.5 μL,12 μL 去 RNase水。反應條件為:42 ℃,60 min;70℃,15 min。反應產(chǎn)物(大鼠cDNA)在-20℃保存。
根據(jù)大鼠Ngb基因的全長序列設計引物:Ngb上游引物:5′-ATAGGTACCATGGAGCGCCTAGAGT CAGA-3′,Ngb 下游引物:5′-AATGGATCCTTACTCC CCGTCCCAGCCTCG-3′以大鼠cDNA為模板,使用Prime STAR?HS DNA Polymerase試劑盒進行PCR擴增。50 μL反應體系包括:1 μL反轉(zhuǎn)錄反應液,10 μL5× Prime STAR Buffer(Mg2+plus),0.5 μLNgb 上游引物(20μmol/L),0.5μLNgb下游引物(20μmol/L),4 μL dNTP Mixture,0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL),33.5 μL dH2O。反應條件為:94℃3 min,98℃10 s→68℃1 min,共30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒切膠回收上述Ngb基因PCR擴增產(chǎn)物(456 bp)。經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切后,回收備用。
1.2.2 重組真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb的構(gòu)建及鑒定:將上述回收純化的Ngb基因PCR擴增產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,挑取陽性菌落提取重組質(zhì)粒pMD19-Ngb。分別使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ對pMD19-Ngb及pAcGFP1-C1商品化空載體進行雙酶切處理。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物,切膠回收pAcGFP1-C1/KpnⅠ/BamHⅠ線性載體片段和pMD19-Ngb/KpnⅠ/BamHⅠ中的Ngb基因片段,將二者使用DNA連接酶進行連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,提取重組表達質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb并進行核苷酸序列測定。
1.2.3 重組真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞及其表達:質(zhì)粒DNA的制備:大量提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb,分光光度計測定并計算質(zhì)粒濃度,保存?zhèn)溆谩?/p>
神經(jīng)母細胞瘤細胞培養(yǎng):神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)在37℃、5%CO2條件下置于10%胎牛血清的DMEM液中培養(yǎng)。2 d換液1次,2~3 d用消化液常規(guī)消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行各項實驗。在進行轉(zhuǎn)染的前1 d,將細胞間隔交叉接種在6孔培養(yǎng)板,細胞密度為2×105/孔,培養(yǎng)24 h達60%~80%融合。
pAcGFP1-C1-Ngb質(zhì)粒的脂轉(zhuǎn):將SH-SY5Y細胞分為2組,轉(zhuǎn)染組和空白對照組,轉(zhuǎn)染組按照Lipofectamine2000說明書進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集2組細胞檢測Ngb蛋白的表達。
蛋白表達的檢測:轉(zhuǎn)染后48 h,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況。Western blot檢測2組細胞Ngb表達情況。
Ngb目的基因PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳,凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果,于500 bp附近可見一較亮條帶,未見有非特異條帶存在(見圖1)。
雙酶切產(chǎn)物中Ngb基因片段和線性載體pAcGFP1-C1經(jīng)純化后的電泳鑒定結(jié)果(圖2、圖3)。
倒置熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染48 h后,重組質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb轉(zhuǎn)染組細胞發(fā)出綠色熒光(圖4),而空白對照組無綠色熒光發(fā)出。
轉(zhuǎn)染組SH-SY5Y細胞中Ngb蛋白表達明顯高于對照組細胞(圖5)。
Ngb是Burmester等在人和小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類攜氧球蛋白,由151個氨基酸組成的單體蛋白,分子量為17 kDa。Ngb具有獨特的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu),Ngb基因缺乏TATA閱讀框。Ngb與血紅蛋白、肌紅蛋白同屬球蛋白家族,但氨基酸序列相似性很?。ㄅc血紅蛋白的同源性小于21%,與肌紅蛋白的同源性小于25%),這表明Ngb在進化上和功能上具有獨特性。Ngb主要在腦組織、視網(wǎng)膜及內(nèi)分泌組織中表達[1]。Ngb能夠可逆地結(jié)合氧,且與氧有很高的親和力,能夠特異性地向神經(jīng)組織供氧[2]。受此啟發(fā),對缺血缺氧性視神經(jīng)、視網(wǎng)膜疾病的治療提供了新思路。
為了進一步研究Ngb的結(jié)構(gòu)和功能,我們從雄性SD大鼠腦組織中提取總RNA,根據(jù)引物設計采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,經(jīng)測序分析,獲得其編碼序列為456個堿基,與基因庫里的大鼠Ngb編碼區(qū)序列完全一致,沒有堿基發(fā)生突變。隨后我們將PCR擴增的目的片段連接到T載體(TS-Ngb),利用基因重組技術(shù)將TS-Ngb及目的載體pAcGFP1-C1進行雙酶切,進行連接,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pAcGFP1-C1-Ngb。
質(zhì)粒pAcGFP1-C1是一種真核表達質(zhì)粒,由GFP報告基因、SV40啟動子、多克隆酶切位點和卡那霉素及新霉素抗性基因等組成。報告基因GFP是最早從水母中分離出來,其基因編碼區(qū)序列長714 bp,蛋白相對分子量約26 kDa。用波長約450~490 nm的藍光線激發(fā)后發(fā)出綠色熒光,可通過熒光顯微鏡直接觀測。GFP無需任何的作用底物或共作用物。檢測的靈敏度不受反應效率的影響,保證了極高的檢出率。GFP蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定,可在多種異源生物中表達且無細胞毒性。GFP基因片段長度較小,易于構(gòu)建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性,為研究其他基因表達產(chǎn)物的分布提供了方便。GFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子,而且其N及C端均可融合,并不影響其發(fā)光。
本實驗成功構(gòu)建了GFP與Ngb基因直接嵌合生成的真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb,以表達產(chǎn)生融合蛋白,既保留了Ngb蛋白的神經(jīng)保護活性,又能通過融合蛋白表達后仍能保持熒光激發(fā)活性。在后來的實驗中,我們將pAcGFP1-C1-Ngb轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中,倒置熒光顯微鏡下可明顯觀察到細胞呈綠色熒光,說明融合蛋白成功表達。而對轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細胞Westernblot檢測也進一步說明Ngb基因已成功插入到真核表達載體pAcGFP1-C1中,真核表達載體構(gòu)建成功。為后續(xù)的實驗研究打下了基礎。
[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et al.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520-523.
[2]Mammen PP,Shelton JM,Goetsch SC,et al.Neuroglobin,a novel member of the globin family,is expressed in focal regions of the brain[J].J Histochem Cytochem,2002,50(12)∶1591-1598.
[3]Sun Y,Jin K,Mao XO,et al.Neuroglobin is up-regulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(26):15306-15311.
[4]Sun Y,Jin K,Peel A,et al.Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(6):3497-3500.
[5]Yu DY,Cringle SJ.Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease[J].Prog Retin Eye Res,2001,20(2):175-208.
[6]Jiang T,Xing B,Rao J.Recent developments of biological reporter technology for detecting gene expression[J].Biotechnol Genet Eng Rev,2008,25:41-75.
[7]Querido E,Chartrand P.Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells[J].Methods Cell Biol,2008,85:273-292.