1種新型功能性雜交胰島β細(xì)胞系的建立

李曉航，張佳林，李樂，康鐵利，程穎，石蕊，張城碩，趙寧，劉永鋒

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，肝膽外科暨器官移植科，沈陽110001）

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病之一［1］。胰島移植作為1種治療Ⅰ型糖尿病的方法日益為人們所關(guān)注［2］。雖然胰島移植在臨床上取得了突破性進展，但是由于2個或多個供腺才能產(chǎn)生足夠的胰島素，它的推廣應(yīng)用受到了限制。因此，多渠道獲得胰島是解決胰島不足的當(dāng)務(wù)之急。目前，雖然在胰島獲得方面取得了一些經(jīng)驗，但在方法上都存在不同程度的缺陷［3～5］。電融合技術(shù)在雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體領(lǐng)域已應(yīng)用多年［6］。理論上，由正常胰島β細(xì)胞與永生化細(xì)胞融合形成的細(xì)胞應(yīng)該具備永生化細(xì)胞系的永生能力及正常胰島β細(xì)胞的胰島素生物合成及分泌特性。因此，本研究擬應(yīng)用電融合技術(shù)構(gòu)建1種與正常胰島β細(xì)胞功能相似的大鼠雜交胰島β細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量150～200 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。膠原酶Ⅴ型、Ficoll 400、雙硫腙、吖啶橙、碘化丙錠及Hoechst33258染液均購于美國Sigma公司；潮霉素購于瑞士Roche公司；猿猴病毒大 T 抗原基因（SV40 LTag）、胰島素（insulin）、葡萄糖轉(zhuǎn)運體-2（Glut-2）及葡萄糖激酶（GK）等蛋白抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；ELISA試劑盒購自美國RD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)對照組RIN-m5F細(xì)胞。

1.2.2 原代成纖維細(xì)胞的獲得及篩選：參照文獻(xiàn)記載的膠原酶消化SD胎鼠皮膚獲得［7］。我們在前期研究中已篩選出永生化成纖維細(xì)胞［8］。

1.2.3 胰島細(xì)胞的準(zhǔn)備及培養(yǎng)：按照文獻(xiàn)［9］記載的膠原酶裂解SD大鼠胰腺獲得新鮮大鼠胰島，加入胰蛋白酶/EDTA和DNA酶制成單細(xì)胞懸液。加入含1.28 mmol/L鈣及40 mg/mL牛血清白蛋白緩沖液中復(fù)蘇細(xì)胞后，將細(xì)胞再次懸浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.4 構(gòu)建胰島素分泌細(xì)胞系：將胰島β細(xì)胞及永生化成纖維細(xì)胞懸浮于無菌的甘露醇基質(zhì)的電融合緩沖液中（0.3 mmol/L甘露醇，0.5 mmol/L HEPES，0.05 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L MgSO4，0.05%BSA，pH7.2，濾器過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆茫?。永生化成纖維細(xì)胞和胰島β細(xì)胞按1︰5比例混合成6×106/mL的1 mL懸浮細(xì)胞電融合液，每次取40 μL細(xì)胞懸液移至電融合小室（ECM 830，美國BTX公司），調(diào)節(jié)電融合儀，使場強至1.6 kV/cm，脈沖寬度為40 μs，脈沖個數(shù)為3。采用AO/PI熒光染色法判定融合細(xì)胞活性＞80%。10 min后，將細(xì)胞融合混合液轉(zhuǎn)移至24孔板培養(yǎng)。

1.2.5 胰島素分泌細(xì)胞系的篩選及克隆雜交：將細(xì)胞融合混合液分入24孔板。通過ELISA試劑盒測定培養(yǎng)8 d的細(xì)胞中胰島素的分泌量，并與正常胰島β細(xì)胞進行比較。按照篩選流程，從孔板中篩選具有高胰島素分泌量的細(xì)胞進行培養(yǎng)。篩選過程反復(fù)進行，最后分離并克隆出具有高胰島素分泌量的細(xì)胞進行下一步研究。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：通過胰蛋白酶消化獲得雜交胰島β細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁生長于6孔培養(yǎng)板中（5×105/孔）。PBS清洗2次，離心，棄上清。用2.5%戊二醛4℃固定2 h。觀察細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.7 測定雜交細(xì)胞胰島素含量：接種雜交胰島β細(xì)胞懸浮液（1×106/孔），過夜細(xì)胞貼壁生長，棄培養(yǎng)液，加入500 μL 酸乙醇（1.5%HCl，75%ethanol，23.5%去離子水）吹打，4℃過夜。收集上清測定細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量。

1.2.8 雜交胰島β細(xì)胞體外功能評價：在37℃孵箱內(nèi)測定細(xì)胞對葡萄糖刺激胰島素釋放反應(yīng)，測定胰島素含量方法參照文獻(xiàn)［10］。計數(shù)2×104個雜交胰島β細(xì)胞，在含0.5%胎牛血清以及2.8 mmol/L或16.7mmol/L葡萄糖溶液的1.5 mL RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h。收集上清液，用ELISA試劑盒測定胰島素含量。胰島素釋放指數(shù)通過高糖環(huán)境（16.7 mmol/L）與低糖環(huán)境（2.8mmol/L）的胰島素含量做比計算獲得。正常胰島β細(xì)胞作為陽性對照。

1.2.9 細(xì)胞增殖分析：通過生長曲線法觀察雜交胰島β細(xì)胞增殖。將雜交胰島β細(xì)胞接種于24孔板（1×104/孔），置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。接種時間記為1 d，之后每天取3孔計數(shù)，求平均值，連續(xù)測定8d。以培養(yǎng)時間（d）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度（細(xì)胞數(shù)/mL）為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。細(xì)胞培養(yǎng)使用不含生長激素的培養(yǎng)基。

1.2.10 半定量RT-PCR分析：使用Trizol提取雜交胰島β細(xì)胞總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。在包括1 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、DNA聚合酶和0.4 μmol/L特異引物在內(nèi)共計25 μg的反應(yīng)體系內(nèi)進行DNA擴增。引物序列及RT-PCR參數(shù)見表1。通過含有Genefinder（1︰10000）的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并記錄。以正常胰島β細(xì)胞做為陽性對照。

1.2.11 Western blot：用細(xì)胞提取緩沖液裂解細(xì)胞，取15 mg蛋白質(zhì)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜。10%牛奶封閉，加入1︰200～1︰500稀釋的一抗（鼠單克隆抗β-actin抗體，鼠單克隆抗SV40 LTag抗體，鼠單克隆抗胰島素抗體，鼠單克隆抗Glut-2抗體及鼠單克隆抗GK抗體）孵育，加入標(biāo)記辣根過氧化物酶的抗鼠IgG抗體的二抗，ECL顯色。正常胰島β細(xì)胞作陽性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 永生化成纖維細(xì)胞的建立

采用有限稀釋法獲得6個永生化成纖維細(xì)胞克隆，分別標(biāo)記為1～6號。永生化成纖維細(xì)胞呈多角形或長梭形，與原代成纖維細(xì)胞無明顯區(qū)別，其增殖能力明顯高于原代成纖維細(xì)胞，RT-PCR及Western blot均可檢測永生化成纖維細(xì)胞中SV40 Ltag的陽性表達(dá)［8］。

2.2 永生化雜交胰島β細(xì)胞的建立

電融合3 d后細(xì)胞呈長梭形、多邊形或不規(guī)則形，貼壁生長（圖1A、1B）。經(jīng)有限稀釋法篩選出的雜交胰島β細(xì)胞克隆呈短梭形或扁圓形，貼壁生長（圖1C、1D）。共篩選出9個雜交胰島β細(xì)胞克隆。透射電子顯微鏡下可見正常胰島細(xì)胞內(nèi)有較多胰島素分泌顆粒（圖2A、2B）；雜交胰島β細(xì)胞內(nèi)也可見散在分布的胰島素分泌顆粒（圖2C、2D）。

2.3 永生化雜交胰島β細(xì)胞的特征

通過生長曲線觀察雜交胰島β細(xì)胞與永生化成纖維細(xì)胞之間的增殖能力無明顯區(qū)別（P>0.05）（圖3）。雜交和正常胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量［分別為（227.40±7.90）和（246.32±8.82）μU/mL］無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）（圖4）。正常胰島β細(xì)胞在低糖和高糖刺激下胰島素分泌量明顯高于雜交胰島β細(xì)胞（P<0.05）；但2者在胰島素釋放指數(shù)上無明顯差別（表2）。RT-PCR及Western blot均可檢測到雜交胰島 β細(xì)胞SV40 LTag的表達(dá)（圖5，圖 6）。insulin、Glut-2和GKmRNA表達(dá)水平在正常及雜交胰島β細(xì)胞中無顯著差異（P>0.05），但均明顯高于RIN-m5F 細(xì)胞（P<0.05）（圖 7，圖 8）。Western blot結(jié)果相似（圖 9，圖10）。

3 討論

目前，胰島移植是治療糖尿病的最有效手段之一，而胰島短缺是限制臨床胰島移植發(fā)展的主要障礙。因此，學(xué)者們嘗試建立1種能穩(wěn)定分泌胰島素的細(xì)胞系，以期增加胰島細(xì)胞來源。Narushima等［11］利用含有SV40 LTag和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶cDNAs重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染人胰島β細(xì)胞，成功建立“永生化”人胰島β細(xì)胞系（NAKT-15），是迄今為止最理想的1種β細(xì)胞系，能根據(jù)血糖的變化合成和分泌胰島素。把該細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，2周后血糖就降至正常水平，且未形成腫瘤，但是否有致瘤性仍有待于進一步研究。McClenaghan等［12，13］通過電融合法將NEDH大鼠胰島β細(xì)胞和RIN-m5F細(xì)胞進行雜交融合，建立了3種新的克隆細(xì)胞系（BRIN-BG5、BRIN-BG7 和 BRIN-BD11），既有無限增殖潛能，又保持了正常胰腺β細(xì)胞的重要功能特征。其中功能最好的是BRIN-BD11細(xì)胞系，可持續(xù)穩(wěn)定傳代超過50代，胰島素分泌能力及GSIS均較父代RIN-m5F細(xì)胞明顯增強，與大鼠正常胰島細(xì)胞極相似，且表達(dá)高水平Glut-2。體內(nèi)實驗表明，移植BRIN-BD11可有效控制糖尿病裸鼠的血糖水平［14］。

目前，NAKT-15及BRIN-BD11細(xì)胞系功能最為良好和穩(wěn)定。然而，NAKT-15通過2次病毒感染篩選而來，操作復(fù)雜，耗時長，成本高。Barbu等［15］認(rèn)為即使以感染效率高的腺病毒顆粒感染人或大鼠的胰島細(xì)胞團，也僅有30%的胰島細(xì)胞被感染，且主要為細(xì)胞團外圍的非β細(xì)胞。因此，需要將胰島細(xì)胞消化成單細(xì)胞再進行感染，但胰島單細(xì)胞較嬌嫩，且需要感染2次，故對胰島細(xì)胞的需求量較大，限制了其應(yīng)用。McClenaghan首次嘗試應(yīng)用電融合方法建立雜交胰島β細(xì)胞系，取得了可喜的結(jié)果，但RIN-m5F為父代細(xì)胞之一，有潛在的致瘤性。

自McClenaghan應(yīng)用電融合建立BRIN-BD11細(xì)胞系以后，電融合儀器已不斷改善，能更精確地調(diào)節(jié)融合參數(shù)，控制融合過程。本研究嘗試應(yīng)用BTX公司ECM830電融合儀融合永生化成纖維細(xì)胞和胰島單細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法已獲得9個雜交胰島β細(xì)胞克隆。經(jīng)擴大培養(yǎng)檢測發(fā)現(xiàn)雜交胰島β細(xì)胞增殖能力明顯改善，與永生化成纖維細(xì)胞接近。葡萄糖刺激胰島素分泌試驗證明雜交胰島β細(xì)胞對血糖變化較敏感，與正常胰島β細(xì)胞相比無顯著差異。其細(xì)胞內(nèi)胰島素含量和正常胰島β細(xì)胞相比也無明顯差別，insulin、Glut-2和GK的相對表達(dá)量與正常胰島細(xì)胞相比也無明顯差別，均顯著高于RIN-m5F細(xì)胞，提示此雜交胰島β細(xì)胞既具有永生化成纖維細(xì)胞體外分裂增殖的能力，又具有胰島β細(xì)胞合成分泌胰島素的特性。雖然雜交胰島β細(xì)胞對葡萄糖變化有一定敏感性，但分泌的胰島素量較正常胰島β細(xì)胞偏少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。然而，2種細(xì)胞內(nèi)胰島素含量無明顯差異。提示雜交胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素顆粒的轉(zhuǎn)運和釋放可能存在缺陷，因而將成為下一步研究的方向之一。

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