動物低氧實驗箱自動控制系統(tǒng)的組建及其在缺氧缺血腦損傷動物模型制作中的應用

侯偉健，佟浩，柏樹令，陳慶和，田曉紅，張保功

（中國醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院組織工程學教研室；2.實驗設備處；3.基礎醫(yī)學院解剖學教研室，沈陽110001）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是由于圍產(chǎn)期供血閉塞、窒息缺氧導致胎兒或新生兒腦的缺氧缺血性損傷。該病對患兒腦發(fā)育可造成嚴重的影響，產(chǎn)生一系列神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。HIE的死亡率高，存活者常有輕重不一的神經(jīng)后遺癥。因此，HIE被認為是兒童神經(jīng)傷殘的重要病因之一。國內(nèi)外研究者［1，2］對HIE的致病機制和治療方法進行了長期、細致的研究，積累了一定的經(jīng)驗并取得了較大的進展，但仍有較多的問題需進行深入研究。在缺氧缺血性腦損傷的致病和再生機制的研究中，適當?shù)膭游锬Ｐ褪遣豢扇鄙俚?。目前最為常用的?jīng)典動物模型是參照 Rice等［3］于1981年制作的新生大鼠缺氧缺血腦損傷（hypoxia and ischemia brain damages，HIBD）模型，對新生 7 d大鼠手術結扎單側頸總動脈并經(jīng)低濃度氧（8%）處理數(shù)小時，?？傻玫捷^好的缺氧缺血效果，適于進行較長時程的大腦神經(jīng)病理與功能損害的研究。該制作過程主要由手術和術后低氧處理兩大部分組成，二者缺一不可。用該方法制作動物模型，手術部分比較容易實現(xiàn)，但穩(wěn)定可靠的低氧處理條件則是一個需要解決的重要問題。不同的研究者基于各自的條件采用不同的方法進行低氧處理，得到了相應的處理結果［4，5］。本實驗室不具有此種低氧處理條件，我們根據(jù)細胞培養(yǎng)CO2孵箱的原理并參考國外的專用設備，自行購買相應的組（配）件，組建了可以人為設置并由儀器自動調(diào)節(jié)控制氧濃度的動物低氧處理箱，并利用其進行新生大鼠缺氧缺血模型的制作，得到了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新生7 d齡SD大鼠（中國醫(yī)科大學實驗動物部），KY-2F型控氧儀及氧濃度檢測探頭（浙江省建德市梅城電化儀器廠），透明有機玻璃密閉箱（50 cm×40 cm×40 cm，中國醫(yī)科大學解剖技術室制做），電磁感應開關（QIANJI RELAY Co.LTD），電磁閥（國產(chǎn)），高壓氮氣（沈陽醫(yī)用氣體廠），超低溫冰箱（-80℃，SANYO，MDF-U32V），細胞超聲破碎儀（美國Sonics&Materials公司，Model：Vcx130），低溫高速離心機（SIGMA1-15k，德國），Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所），酶標儀（Bio-Rad Model 680），HIF-1α抗體（北京博奧森生物技術公司），Cofilin和 p-Cofilin抗體、LIMK 抗體、Erk及p-Erk抗體（美國Santa Cluz公司），HRP-標記羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術公司），化學發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術研究所），醫(yī)用X線感光膠片（Kodak公司，廈門醫(yī)用膠片廠），免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 低氧箱自動氧濃度控制系統(tǒng)的組建與調(diào)試：利用自制的透明有機玻璃密閉箱，連接購買的KY-2F型控氧儀，同時在控氧儀的信號輸出端連接電磁感應開關，電磁感應開關之后連接電磁閥門，氮氣管路通過此電磁閥門進入密閉箱。

調(diào)試使用及工作原理：連接控氧儀電源線，安裝氧濃度檢測探頭，打開儀器電源主開關。儀器首先初始化并與大氣中氧平衡，調(diào)整儀器微調(diào)旋鈕使顯示為21.0%，設置控氧范圍上限為9.9%。打開氮氣瓶總閥，再打開減壓表閥門，使氮氣通過管道進入密閉箱。隨著氮氣的進入，密閉箱中的氧氣濃度逐漸降低，氧檢測探頭將檢測信號送入控氧儀，并通過儀器的輸出端，將氧濃度信號送入電磁感應開關，由感應開關的動作控制器下方的電磁閥門開關。當儀器檢測的氧濃度值高于設定值時，感應開關打開，電磁閥門打開，氣體進入密閉箱；而當儀器檢測密閉箱中的氧濃度低于設定值（9.9%）時，感應開關關閉，并控制電磁閥門關閉，此時氮氣停止進入密閉箱。在電磁閥門關閉后的一段時間內(nèi)，密閉箱中的氧濃度仍有一段慣性降低，一般可繼續(xù)降低1.0%～2.0%（隨通入氮氣的速度而不同），實際值可達7.5%～8.5%。隨后改調(diào)儀器的控制上限值（8.5%）和氣體通入速度，可使密閉箱中的氧濃度值基本穩(wěn)定于8.0%～8.5%范圍內(nèi)。一旦氣體流量和設置上限調(diào)節(jié)完畢，整個系統(tǒng)即可自動進行調(diào)節(jié)維持密閉箱中氧濃度的恒定。

1.2.2 HIBD模型手術：取7 d齡新生大鼠，體質(zhì)量10～14 g，分為手術組與假手術組，2%水合氯醛腹腔注射麻醉（10 mL/kg）后，仰臥固定于手術臺上，頸正中切口，分離左側頸總動脈，于動脈下方穿入手術線雙點結扎，并于雙結扎點中間剪斷血管，縫合切口。動物術后放于35℃溫箱中復蘇2～4 h后，將手術組動物放入缺氧密閉箱中低氧（8.0%～8.5%）處理2～2.5 h，然后放入母鼠籠中，由母鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。術后動物按1h，12 h，24 h，48 h，72 h，7 d，14 d，21 d 分組處死取腦組織，于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆没蛴?%多聚甲醛灌流固定以備進行免疫組化檢測。

1.2.3 Western blot檢測細胞內(nèi)與損傷相關的信號蛋白表達：取各處理組大鼠大腦皮層組織1～2 mg，加入RIPA裂解液（含100 μmol/L PMSF），冰上裂解30 min，0～4℃下超聲粉碎。利用Bradford法測定蛋白濃度，計算后用5×蛋白上樣緩沖液（loading buffer）調(diào)整至50 μg/樣品，加熱100 ℃處理5 min。（1）配膠：分離膠濃度11.5%，濃縮膠濃度4%，上樣進行SDS-PAGE電泳，電壓70～110V，電泳時間約100 min。經(jīng)電轉移將電泳分離膠中蛋白區(qū)帶轉移至PVDF膜，電壓100 V，時間2 h。轉移后的PVDF膜用5%脫脂奶粉-TBST溶液封閉1 h；（2）多克隆一抗 ：HIF-1α、LIMK、cofilin、p-Cofilin、Erk、p-Erk 及 內(nèi)參β-actin按適當稀釋度稀釋后與膜的適當位置孵育4℃過夜，TBST溶液洗5 min×4；HRP標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗5 min×4；暗室中用化學發(fā)光試劑顯跡，X線膠片感光記錄。

1.2.4 免疫組化法檢測特定蛋白在細胞內(nèi)的表達：模型動物經(jīng)心臟灌流，用生理鹽水沖出血液，然后灌注4%多聚甲醛（溶于0.1 mol/L PBS）約100 mL，至四肢抽搐變硬，取出腦組織，浸泡于4%多聚甲醛固定。數(shù)日后經(jīng)石蠟包埋切片，切片脫蠟和水化后，PBS沖洗3次，加1滴過氧化物酶阻斷溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗后，加1滴小牛血清及50 μL Cofilin或 p-Cofilin一抗（Santa Cruze），室溫下孵育60 min，PBS沖洗后，加生物素標記的第二抗體，室溫孵育10 min，然后依次加入鏈霉卵白素—過氧化物酶溶液及DAB酶底物顯色劑等，光鏡下觀察3～10 min后，自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 密閉低氧動物實驗箱氧控系統(tǒng)在缺氧缺血動物模型處理中的自動控制效果

氮氣瓶、低氧密閉箱、氧感應探頭和控氧儀及其他控制開關和閥門連接安裝后，放入頸總動脈結扎手術后的幼大鼠，關閉密閉箱蓋，儀器先與大氣氧平衡，校準儀器顯示氧濃度為21%，然后開始通入氮氣。隨著氮氣的輸入，儀器測量的氧濃度值逐漸降低，至設定的上限值時電磁閥門自動關閉。此后一段時間氮氣停止輸入，密閉箱內(nèi)的氧濃度維持在設定范圍內(nèi)，當密閉箱內(nèi)氧濃度再度升高超過設定上限值時，電磁閥門再次自動開啟，氮氣輸入，氧濃度再度降低。如此維持密閉箱中的氧濃度基本穩(wěn)定在設定范圍內(nèi)。

2.2 大鼠缺血術后低氧處理腦損傷直觀效果

缺氧缺血處理后1，3，7，14 d取腦組織標本觀察腦損傷直觀效果并留樣待測。部分標本缺氧缺血損傷效果明顯，肉眼可見明顯缺血缺氧損傷灶，左腦后側部皮質(zhì)明顯蒼白或皮質(zhì)組織液化或塌陷（圖1）。

2.3 Western blot檢測 HIF-α、LIMK、Cofilin 及 ERk等蛋白的表達

結果可見，在缺氧缺血后不同的時間段，大腦皮質(zhì)細胞中蛋白表達及化學修飾發(fā)生不同的改變（圖2）。

2.4 缺氧缺血后不同時間大鼠腦免疫組化表達

結果顯示，用Cofilin和p-Cofilin抗體孵育雜交，可見不同處理對大鼠腦海馬細胞產(chǎn)生不同的影響，缺氧缺血后損傷腦組織p-Cofilin明顯比對照組增強，也比相同實驗組的Cofilin表達明顯增強。見圖3。

3 討論

在新生兒發(fā)育期，腦組織代謝非常旺盛，氧耗量最大，對缺氧極其敏感，易造成缺氧性損傷［6］。圍產(chǎn)期的缺氧缺血性腦損傷常由于血液供應障礙（同時缺氧）引起。在缺血缺氧性腦損傷動物模型的制作過程中，頸總動脈結扎手術較易實現(xiàn)，而缺氧條件的實現(xiàn)則有一定的困難，其中氧濃度的測控則成為一個重要的限制因素。目前一些實驗室采用從醫(yī)用氣體廠購買事先按比例混合好的O2（8%）和N2（92%）混合氣體，使用時直接將混合氣體通入一個密閉容器中［4，5，7］。此種方法操作容易，但無法實時測知密閉箱中的確切氧濃度及其變化，無法隨時調(diào)控氧的濃度，實際氧濃度值往往高于預期（8%）。

本實驗借鑒了國外同類設備的調(diào)控機制，利用反饋調(diào)節(jié)的原理，采用簡單而經(jīng)濟實用的方法和配件，自行組配了可以自動調(diào)節(jié)氧濃度的低氧動物處理箱。經(jīng)過數(shù)十次實驗，證實其使用的可行性和可靠性。用該低氧箱制作的動物缺氧缺血模型，從腦組織形態(tài)到細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達和修飾及免疫組化等方面，都可獲得明顯的改變。

從本實驗結果可以看到，在損傷較輕時，基本無異?？梢娀蚵杂心[脹；當損傷加重時可見左腦組織變蒼白；當損傷進一步加重時，則可見左腦皮質(zhì)甚至海馬出現(xiàn)液化壞死，腦組織損傷現(xiàn)象與文獻報道相似［7，8］。從腦組織明顯損傷的情況看，本低氧處理箱的作用與缺血手術的聯(lián)合作用是明顯的。

從Western blot結果上看，缺氧缺血側的腦組織細胞中某些分子表達和修飾狀態(tài)也發(fā)生了明顯改變。HIF-1α的表達在缺氧缺血誘導后隨時間增加而逐漸增高，72 h后又逐漸降低。HIF-1α是由低氧誘導的，在缺氧狀態(tài)下HIF-1α的表達被誘導升高，進而激活紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、糖酵解酶等多種基因的轉錄，可提高機體對缺氧缺血的耐受［9］。缺氧缺血也引起了其他一些蛋白的表達和修飾的改變，如Cofilin等蛋白表達量的變化。由實驗結果可見，Cofilin在缺氧缺血條件下先升高而后逐漸降低。LIMK是Cofilin的上游信號分子，LIMK的激活引起Cofilin的磷酸化，后者在細胞中先升高（24 h）然后降低，至14 d又出現(xiàn)高峰，21 d降低。Cofilin具有切割肌動蛋白纖絲的活性，而p-Cofilin則使Cofilin蛋白失活，從而提高F-肌動蛋白的穩(wěn)定性，或促進G-肌動蛋白聚合成F-肌動蛋白的功能［10］。

在缺氧缺血條件下，ERK的磷酸化形式（p-ERK）亦有較大改變，且類似p-Cofilin的變化趨勢，也出現(xiàn)2個高峰。ERK是MAPK家族的一員，受到生長因子等有絲分裂的刺激，并參與多種細胞的增殖、分化、凋亡及遷移等細胞行為。ERK受多種因素刺激可被廣泛激活，在細胞增殖以及在細胞分化發(fā)育惡性轉化中發(fā)揮重要作用，近來有報道其在缺氧缺血腦損傷后大鼠腦中表達升高，并與GAP-43等敏感基因表達相關［11，12］。

從免疫組化結果來看，缺氧缺血后損傷腦組織p-Cofilin表達明顯比對照組增強，也比相同實驗組的Cofilin表達明顯增強。Cofilin作為一種絲切蛋白，具有切斷絲狀肌動蛋白的作用，在細胞的遷移、發(fā)育及再生過程中起重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)缺氧缺血腦損傷后大腦海馬組織中Cofilin蛋白磷酸化明顯增強，其具體意義尚有待探討。

綜上所述，本實驗中低氧箱自動調(diào)控系統(tǒng)基本上是可靠的，其效果是明確的，但仍存在一些問題。如在使用中尚需人為監(jiān)測氧氣濃度降低的速度，過快的速度則容易引起動物死亡，造成實驗失敗。因此，本低氧箱尚需進一步改進和完善，使其更加適用于動物缺氧缺血腦損傷方面的研究。

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