HER2/neu和Akt2在胃癌中的表達(dá)及意義

王士娜，馬靜，楊立宇，王星，吳璠，宦大為，王翠芳

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院病理科，沈陽(yáng)110024；2.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng)110031；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第92期七年制臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，沈陽(yáng)110001；4.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽(yáng)11003 6）

在我國(guó)胃癌屬高發(fā)腫瘤，且單純手術(shù)治療效果并不理想，患者術(shù)后5年的生存率低于30%［1］，主要仍依靠化療為主的綜合治療作為預(yù)防胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的手段，但由于化療過(guò)程中往往存在腫瘤細(xì)胞的耐藥性，因而為胃癌的治療尋找有效的生物學(xué)標(biāo)志物成為目前的研究熱點(diǎn)。Bacus等［2］在乳腺癌中的研究顯示，具有HER2/neu過(guò)表達(dá)的腫瘤其不良預(yù)后及對(duì)化療藥物的抵抗作用的發(fā)揮依賴(lài)于PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，而Akt2的過(guò)表達(dá)對(duì)這一作用的發(fā)揮起到關(guān)鍵的作用。研究表明，HER2/neu、PI3K、Akt2在胃癌中均有表達(dá)［3］，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到關(guān)于HER2/neu與Akt2在胃癌中相關(guān)性的研究報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)80例胃癌及40例正常胃組織（慢性胃炎、胃潰瘍）中HER2/neu及Akt2的表達(dá)情況及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，并通過(guò)分析二者之間的一致性進(jìn)一步探討HER2/neu-PI3K-Akt通路對(duì)胃癌臨床治療的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源：80例胃癌和40例正常胃組織（取自慢性胃炎、胃潰瘍患者手術(shù)切除胃組織周邊正常胃黏膜）標(biāo)本均來(lái)自沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院病理科2006年11月至2011年1月手術(shù)切除存檔蠟塊。80例胃癌患者中，男55例，女25例；平均年齡63歲，年齡最大者86歲，最小者42歲；根據(jù)Lauren分型：腸型34例，彌漫型40例，混合型6例；根據(jù)組織學(xué)分級(jí)：高中分化腺癌34例，低分化腺癌46例；臨床分期：Ⅰ/Ⅱ期38例，Ⅲ/Ⅳ期42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；侵及漿膜者64例，未侵及漿膜者16例。標(biāo)本經(jīng)HE染色評(píng)判標(biāo)本固定良好且無(wú)壞死后納入本研究，所有胃癌標(biāo)本均由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用雙盲法診斷。

1.1.2 試劑：鼠抗人HER2/neu單克隆抗體、SP試劑盒及AEC顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；鼠抗人Akt2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

所用標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，按SP免疫組化染色步驟進(jìn)行操作，用已知表達(dá)抗體的組織作陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定

HER2/neu染色主要定位于細(xì)胞膜，其結(jié)果判定采用修訂后的 HercepTest評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［4］，（0）：無(wú)著色或<10%的細(xì)胞有細(xì)胞膜著色，（+）：>10%的細(xì)胞有輕微膜著色，（++）：>10%的細(xì)胞有弱的膜著色，（+++）：>10%的細(xì)胞有中到強(qiáng)的完全膜著色；（0）和（+）為低表達(dá)，（++）和（+++）為過(guò)表達(dá)。Akt2陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)果判斷采用陽(yáng)性細(xì)胞半定量法［5］，以陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)定陽(yáng)性表達(dá)。首先按陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)瘤細(xì)胞的百分比評(píng)分，＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；再根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，不著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕紅色為3分。兩項(xiàng)得分相加，≤2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)HER2/neu、Akt2在胃癌、正常胃組織中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析；運(yùn)用非參數(shù)Kruskal Wallis檢驗(yàn)對(duì)HER2/neu、Akt2在胃癌中的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系進(jìn)行分析；應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)HER2/neu、Akt2在胃癌中的表達(dá)是否具有一致性進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HER2/neu、Akt2蛋白在胃癌及正常胃組織中的表達(dá)

HER2/neu主要為細(xì)胞膜著色，Akt2主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。HER2/neu在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為17.50%（14/80），在正常胃組織中陽(yáng)性表達(dá)率為0（0/40），胃癌組織與正常胃組織比較HER2/neu陽(yáng)性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.317，P=0.012）；Akt2在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.50%（54/80），而在正常胃組織中陽(yáng)性表達(dá)率為5.00%（2/40），胃癌組織與正常胃組織比較Akt2陽(yáng)性表達(dá)率的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.853，P=0.000）。

2.2 HER2/neu、Akt2的蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

在胃癌中，HER2/neu蛋白的表達(dá)與Lauren分型、組織的分化程度相關(guān)（P<0.05），而與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無(wú)漿膜浸潤(rùn)無(wú)關(guān)（P>0.05）；Akt2的表達(dá)與胃癌Lauren分型、組織學(xué)分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），與有無(wú)漿膜浸潤(rùn)無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 胃癌中HER2/neu和Akt2蛋白表達(dá)的一致性分析

HER2/neu與Akt2蛋白在胃癌中表達(dá)的一致性分析發(fā)現(xiàn)，HER2/neu與Akt2蛋白表達(dá)水平具有一定的一致性（χ2=4.97，P<0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

HER2/neu屬表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，可在缺乏配體的情況下激活下游通路，目前的研究認(rèn)為，由其參與的PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制等密切相關(guān)［6］。研究表明，HER2/neu過(guò)表達(dá)可使乳腺癌患者的無(wú)病生存期明顯縮短、化療療效不明顯并且與疾病的預(yù)后不良相關(guān)［7］。但到目前為止，關(guān)于HER2/neu蛋白在胃癌中的報(bào)道不盡一致，可能由于所選樣本量的多少及所用評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的不同而產(chǎn)生了一些差異，其陽(yáng)性率從10%～55%不等。但大多數(shù)研究均表明，HER2/neu蛋白在腸型胃癌中的表達(dá)率高于彌漫型及混合型，并認(rèn)為具有HER2/neu過(guò)表達(dá)的胃癌患者的無(wú)病生存期明顯縮短［8］。我們的研究結(jié)果顯示，HER2/neu蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（17.50%）與在正常胃組織中的表達(dá)率（0）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；根據(jù)Lauren分型，HER2/neu蛋白在腸型胃癌中的表達(dá)高于其在彌漫型及混合型胃癌，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與其他學(xué)者的報(bào)道一致，提示HER2/neu蛋白的表達(dá)與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且對(duì)患者的不良預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值；在分化程度方面，隨著分化程度的降低，HER2/neu的表達(dá)相應(yīng)增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明HER2/neu的表達(dá)可能與胃癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。HER2/neu蛋白的表達(dá)在臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度方面沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

Akt為HER2/neu-PI3K-Akt通路下游重要的靶激酶，共包括3種亞型。Irie等［9］認(rèn)為，在PI3K-Akt通路中，Akt2與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切；在結(jié)腸癌中的研究表明［10］，Akt2與結(jié)腸癌的早期發(fā)生、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關(guān)；在非小細(xì)胞肺癌中，磷酸化的Akt2的表達(dá)明顯上調(diào)，并且與患者的5年生存期縮短有關(guān)［11］。張慶英等［12］的研究顯示，Akt2 在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為56%，且其持續(xù)活化可以導(dǎo)致下游多條抑制細(xì)胞凋亡的通路被激活，并且增加糖酵解的速度，使葡萄糖氧化生成的ATP水平提高，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在我們的實(shí)驗(yàn)中，Akt2在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.50%，正常胃組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為5.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與已有報(bào)道相近；我們的數(shù)據(jù)還顯示，Akt2的表達(dá)與胃癌的Lauren分型、組織學(xué)分化程度、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（P<0.05），提示Akt2的存在與胃癌的惡性程度有關(guān)；且具有Akt2過(guò)表達(dá)的癌組織其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力可能更強(qiáng)。

Bacus等［2］通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HER2/neu的乳腺癌中Akt1、Akt2的表達(dá)情況及通過(guò)應(yīng)用PI3K/Akt通路的抑制劑證實(shí)，在具有HER2/neu過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中，隨著PI3K/Akt通路被活化，癌基因Akt2被完全激活，進(jìn)而提高了細(xì)胞的耐缺氧能力及抗凋亡能力，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展；并且，活化的Akt2使具有HER2/neu過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞對(duì)激素治療、化學(xué)治療和放射治療均產(chǎn)生了抵抗作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HER2/neu及Akt2在胃癌中的表達(dá)均高于正常胃組織，通過(guò)分析，HER2/neu及Akt2在胃癌中的表達(dá)具有一定的一致性（χ2=4.97，P<0.05），推測(cè)HER2/neu可能通過(guò)PI3K/Akt通路使其下游的靶蛋白Akt2活化，進(jìn)而通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞逃脫正常的程序性死亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期加速運(yùn)行等方式而促進(jìn)胃癌的發(fā)生與發(fā)展。

由于目前對(duì)胃癌的作用機(jī)制還不是很清楚，盡管臨床有較多關(guān)于胃癌的輔助化療方案，但化療的總體有效率仍偏低，近年來(lái)人們也開(kāi)始探討分子靶向性藥物治療胃癌的價(jià)值。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，曲妥珠單抗無(wú)論單用或是與化療聯(lián)用均取得了明顯療效，而具有HER2/neu過(guò)表達(dá)的胃癌患者可否從曲妥珠單抗受益，相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究已初露端倪。目前認(rèn)為，抑制HER2/neu-PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是曲妥珠單抗的重要作用機(jī)制之一，其通過(guò)這條通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用［13］。在具有HER2/neu過(guò)表達(dá)的胃癌肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系中還發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞系中的Akt是磷酸化的，并且該細(xì)胞系對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑吉非替尼敏感性較高，進(jìn)一步的研究證實(shí)，吉非替尼可抑制Akt的磷酸化，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用［14］。

綜上所述，在治療具有HER2/neu、Akt2過(guò)表達(dá)的胃癌時(shí)，曲妥珠單抗和吉非替尼這樣的靶向性藥物有可能會(huì)成為有效的治療武器，相信隨著研究的深入，二者有望成為治療胃癌的新靶點(diǎn)。

［1］陳錦章，鄭航，陳斌，等.VEGF、HER-2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（4）：617-619.

［2］Bacus SS，Altomare DA，Lyass L，et al.AKT2 is frequently upregulated in HER-2/neu-positive breast cancers and may contribute to tumor aggressiveness by enhancing cell survival［J］.Oncogen，2002，21（22）：3532-3540.

［3］Li N，Bu X，Tian X，et al.Fatty acid synthase regulates proliferation and migration of colorectal cancer cells via HER2-PI3K/Akt signaling pathway［J］.Nutr Cancer，2012，64（6）：864-870.

［4］Hofmann M，Stoss O，Shi D，et al.Assessment of a HER2 scoring system forgastric cancer：resultsfrom a validation study ［J］.Histopathology，2008，52（7）：797-805.

［5］Kyo S，Sakaguchi J，Ohno S，et al.High twist expression is involved in infiltrative endometrial cancer and affects patient survival［J］.Hum Pathol，2006，37（4）：431-438.

［6］Artufel MV，Valero AC，Llado RR，et al.Molecular protocol for HER2/neu analysis in breast carcinoma ［J］.Clin Transl Oncol，2005，7（11）：504-511.

［7］喬杉杉，張靜.乳腺癌HER2基因的研究進(jìn)展及其靶點(diǎn)治療［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（11）：96-99.

［8］Hiraashima N，Takahashi W，Yoshii S，et al.Protein overexpression and gene amplification of c-erb B-2 in pulmonary carcinomas：a comparative immunohistochemical and fluorescene in situ hybridization study［J］.Mod Pathol，2001，14（6）：556-562.

［9］Irie HY，Pearline RV，Grueneberg D，et al.Distinct roles of Akt1 and Akt2 in regulating cell migration and epithelial-mesenchymal transition［J］.J Cell Biol，2005，171（6）：1023-1034.

［10］趙紅波，張小元，劉迪，等.人結(jié)腸癌中AKT2和PTEN蛋白表達(dá)的意義及相關(guān)性［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，30（5）：592-595.

［11］蒲蓉，李為民，劉丹，等.AKT2及磷酸化的AKT2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，41（4）：586-589.

［12］張慶英，成文翔，周太梅，等.MFAP3L在胃癌中的表達(dá)及與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系［J］.腫瘤防治研究，2010，37（7）：806-809.

［13］孫杰，潘賽英，陳倩琪，等.曲妥珠單抗聯(lián)合FOLFIRI治療HER2陽(yáng)性晚期胃癌的療效觀察［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（8）：1458-1460.

［14］崔小偉，張慶瑜.HER2/neu在胃癌中的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際消化病雜志，2008，28（4）：309-311.