叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及意義

吳文藝，張麗婷，王朝陽，邱建龍，朱世澤

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科，福建 泉州3 62000；2.解放軍第一八零醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建 泉州3 62000）

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的一種類型，占甲狀腺惡性腫瘤的80%～85%［1］。盡管大部分病例預(yù)后良好，l0年生存率超過90%～95%［2］，但文獻(xiàn)報道甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率近幾十年呈上升趨勢［3］，且依靠現(xiàn)有的方法無法判定臨床頸淋巴結(jié)陰性（cN0）病例有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。如其他系統(tǒng)的腫瘤一樣，基因改變長期以來被認(rèn)為在甲狀腺腫瘤的發(fā)生中起到一個基本的作用［4］，其機(jī)制可能為抑癌基因啟動子的高甲基化［4，5］、基因突變或表達(dá)異常。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子Ml（forkhead box M1，F(xiàn)oxM1）是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在肝癌、乳腺癌和腦惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，被認(rèn)為是促進(jìn)這些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，對這些腫瘤的生長、侵襲及血管形成能力均有重要影響［6～8］。本研究采用實時熒光定量PCR和Western blot，分別從mRNA和蛋白水平檢測FoxM1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)，探討其在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為其早期診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有新鮮組織標(biāo)本均于2011年2月至2012年3月取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科（均取得患者知情同意），其中甲狀腺乳頭狀癌組織20例、癌旁正常甲狀腺組織20例（對側(cè)甲狀腺正常組織）及甲狀腺腺瘤20例作為對照組。甲狀腺乳頭狀癌組中男8例，女12例；年齡26～62歲，中位年齡42歲；其中伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟和美國抗癌協(xié)會2002年的甲狀腺癌臨床分期，I期8例，Ⅱ期6例，Ⅲ期3例，ⅣA期3例。所有病例的癌組織經(jīng)術(shù)后病理證實均為甲狀腺乳頭狀癌，術(shù)前甲狀腺功能均正常，均未接受放、化療，均有完整的臨床和病理資料。所取標(biāo)本均平分切成2份（對側(cè)甲狀腺正常組織平分切成3份，其中1份送病理檢查證實為正常組織），一份置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于Western blot，另一份則置于RNA樣品保存液中，于4℃冰箱中保存，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis kit購自加拿大MBI公司，熒光定量PCR試劑SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本東洋紡生物技術(shù)有限公司，RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒、UltraECL底物化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，兔抗人FoxM1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，紫外可見分光光度計（DU800）購自美國貝克曼庫爾特公司，基因擴(kuò)增儀（PE9600）購自美國ABI公司，熒光定量PCR儀（ABI7500）購自美國ABI公司，凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-2500）購自上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR：應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測20例甲狀腺乳頭狀癌組織及相應(yīng)的20例癌旁正常甲狀腺組織和20例甲狀腺腺瘤組織中FoxM1 mRNA的表達(dá)情況。

1.3.1.1 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 根據(jù)Trizol使用說明書，稱取標(biāo)本各約50 mg抽取其RNA，分光光度計測定各樣品OD260與OD280吸光值，計算比值OD260/OD280，要求在1.80～2.00之間，同時1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。電泳顯示28S、18S和5S條帶完整清晰。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1 μg經(jīng)檢測合格的總 RNA、0.5 μL Oligo（dT）、0.5 μL Random primer、2 μL10 mmol/L dNTPs mix、4 μL5 ×buffer、0.5 μL RNase inhibitor、0.5 μL M-MLV，并加水至20 μL，30℃保溫10 min；42℃保溫60 min；72℃保溫10 min終止反應(yīng)，取出-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 熒光實時定量PCR 按照東洋紡熒光定量PCR試劑使用說明書，混合10 μL SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，10 ummol/L上下游特異引物各0.5 μL，9 μL適當(dāng)稀釋的cDNA模板，總反應(yīng)體積為20 μL，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃5 min（1個循環(huán)）；95℃15 s，60℃15 s，72℃32 s采集熒光信號強(qiáng)度（40個循環(huán)），重復(fù)實驗3次。內(nèi)參基因選用人類18srRNA基因（GenBank 號：NR_003286，Homo sapiens18S ribosomal RNA）。引物序列自行設(shè)計，上游引物：CCTGGA TACCGCAGCTAGGA，下游引物：GCGGCGCAATACG AATGCCCC，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為112 bp；FoxM1上游引物：TGGATCTTGGGTTCTTCACT，下游引物：ACCCA CACTCTGCTTCAGTT，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為200 bp。將PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，確定產(chǎn)物特異性。

1.3.1.3 結(jié)果分析 采用定量PCR儀自帶分析軟件分析各樣品各基因表達(dá)情況。相對定量的計算方法采用2-ΔΔCT法，具體計算公式：ΔΔCT=（CT.Target-CT.Actin）Timex-（CT.Target-CT.Actin）Time0，RQ 值 =2-ΔΔCT。 RQ T.Target與RQ T.Actin的比值即為相對定量值，其中T.Target為目的基因，T.Actin為內(nèi)參基因，Timex為病理樣品，Time0為正常人樣品。

1.3.2 Western blot檢測：應(yīng)用Western blot檢測20例甲狀腺乳頭狀癌組織及相應(yīng)的20例癌旁正常甲狀腺組織和20例甲狀腺腺瘤組織中FoxM1蛋白的表達(dá)情況。每例標(biāo)本取3 g，將組織剪切成細(xì)小的碎片（組織直徑1 mm）。按照每20 mg組織加入150 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。12000 r/min，4℃離心5 min，收集上清，用于后續(xù)實驗。采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BCA法蛋白定量試劑盒測定各樣品總蛋白含量。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入適當(dāng)稀釋的一抗、二抗（一抗稀釋倍數(shù)為200倍，二抗稀釋倍數(shù)為1000倍），ECL化學(xué)發(fā)光法檢測顯影。底片通過凝膠灰度分析軟件Quantity One 4.6.2進(jìn)行灰度值定量。每組實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗或ANOVA分析比較均值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxM1mRNA的表達(dá)情況

FoxM1mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織（41.68±15.65）中呈高表達(dá)，在癌旁正常甲狀腺組織（2.73±1.00）、甲狀腺腺瘤組織（2.32±1.06）中呈低表達(dá)。甲狀腺乳頭狀癌組織中FoxM1mRNA的表達(dá)顯著高于其對應(yīng)的癌旁正常甲狀腺組織（P=0.000）和甲狀腺腺瘤組織（P=0.000）。癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織中FoxM1mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.257）。

2.2 FoxM1蛋白的表達(dá)情況

FoxM1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織（0.897±0.117）中呈高表達(dá)，在癌旁正常甲狀腺組織（0.211±0.029）和甲狀腺腺瘤組織（0.193±0.028）中呈低表達(dá)。甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁正常甲狀腺組織及甲狀腺腺瘤組織比較，F(xiàn)oxM1蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織中FoxM1蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.3 FoxM1mRNA及蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系

在甲狀腺乳頭狀癌組織中，F(xiàn)oxM1mRNA及蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，有包膜侵犯組FoxM1mRNA及蛋白表達(dá)高于包膜無侵犯組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。FoxM1mRNA及蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期均無關(guān)（P>0.05）。見表1。

3 討論

FoxM1是Forkhead蛋白家族中的一員，定位于染色體12p13.3末端著絲粒區(qū)域，全長約25 kb，僅在具有分裂活性的細(xì)胞中表達(dá)。FoxM1與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Wonsey等［9］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1在DNA 合成前期、DNA合成期和有絲分裂期表達(dá)顯著增強(qiáng)，可介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入DNA合成和有絲分裂期。FoxM1對細(xì)胞增殖的影響主要是通過抑制細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑p21Cip1/Waf1和p27Kip，進(jìn)而影響某些細(xì)胞周期素或細(xì)胞周期素依賴性激酶活化劑Cdc25a和Cdc25b磷酸酶的活性來實現(xiàn)的［10］。FoxM1功能的缺失可能阻礙細(xì)胞分化，并最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變［11］。FoxM1基因在多種腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤干細(xì)胞存在和功能的發(fā)揮，如在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、上皮性卵巢癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中異常升高，是促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［6～8，12～19］。

本研究中，熒光實時定量PCR結(jié)果顯示FoxM1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌的表達(dá)明顯高于癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織。Western blot結(jié)果與實時定量PCR結(jié)果一致，F(xiàn)oxM1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織，而癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織FoxM1mRNA及蛋白表達(dá)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。有包膜侵犯組FoxM1mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于包膜無侵犯組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。甲狀腺乳頭狀癌組織中FoxM1表達(dá)異常升高，可能促進(jìn)了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展及包膜的侵襲。劉鋼等［20］的研究表明，凋亡抑制基因Survivin在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織，結(jié)合本研究結(jié)果，我們推論甲狀腺乳頭狀癌組織中FoxM1表達(dá)異常升高，是引起其下游基因Survivin在甲狀腺乳頭狀癌異常表達(dá)的根本原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組FoxM1mRNA及蛋白的表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），這可能是甲狀腺乳頭狀癌易于早期出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原因之一。但它在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中所發(fā)揮的作用及作用的大小以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步證實。

影響甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的因素有性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)癌是否侵出包膜及有無周圍器官侵犯［21］。本研究顯示FoxM1mRNA及蛋白在不同性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期的甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示甲狀腺乳頭狀癌中FoxM1的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期無關(guān)。

綜上，F(xiàn)oxM1的過度表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜侵犯中可能有重要作用，可能是其發(fā)生過程中的早期事件。但FoxM1 mRNA及蛋白在不同性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期的甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)無明顯差異，提示甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病過程中可能有多種因素參與，單一FoxM1的過度表達(dá)并不能預(yù)測甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后，F(xiàn)oxM1在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及確切機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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