張秀麗,梁?jiǎn)危罴t娟,馬健飛,胡曄,樊怡,王力寧
(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,沈陽(yáng),110001;2.本溪市中心醫(yī)院腎內(nèi)科,遼寧 本溪,117000;3.中國(guó)人民解放軍95935部隊(duì),哈爾濱,150000)
腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是慢性腎臟病一體化治療的主要替代治療方法。腹膜纖維化是維持性腹膜透析患者常見的嚴(yán)重并發(fā)癥,是各種原因引起的腹膜問(wèn)題的最后轉(zhuǎn)歸,是導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)改變和超濾功能喪失,患者退出腹膜透析的主要原因之一[1]。無(wú)論是反復(fù)發(fā)生的腹膜炎,還是非生物相容性的腹膜透析液或者腹透液在加熱處理過(guò)程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物,都是引起腹膜纖維化的常見原因[2,3]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的裂解成分,是該類細(xì)菌的主要致病因素之一。腹膜間皮細(xì)胞(peritoneal mesothelial cell,PMC)是腹膜發(fā)揮透析作用的主要細(xì)胞群,在調(diào)節(jié)腹膜功能,抑制炎癥和纖維化中起著關(guān)鍵作用[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導(dǎo)致PMC發(fā)生向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,是腹膜組織發(fā)生纖維化的早期和可逆階段。大量的研究表明,必需微量元素鋅是機(jī)體多種酶的必需組分或激活因子,參與多種信號(hào)通路的傳導(dǎo),具有抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激的作用[5,6]。文獻(xiàn)證實(shí),終末期腎臟病患者,包括已經(jīng)進(jìn)行血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的鋅缺乏[7,8]。以往的研究證實(shí),鋅補(bǔ)充能夠抑制或減輕一些動(dòng)物模型和臨床患者的纖維化。相反,鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化[9]。因此我們有理由推測(cè)鋅離子可能對(duì)PMC的EMT有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在研究鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMC的EMT的影響,從而為鋅離子在PD中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
清潔級(jí)SD雄性大鼠,體質(zhì)量120~160 g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
DMEM/F12干粉培養(yǎng)基和胎牛血清(GIBCO,美國(guó)),胰蛋白酶、兔抗大鼠α?SMA、脂多糖粉劑(Sig?ma,美國(guó)),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日),兔抗大鼠Smad2、Smad3、P?Smad2、P?Smad3、E?cadherin,colla?genⅠ抗體(Santa?Cruz)。TGF?β1 ELISA試劑盒(R﹠D systems,美國(guó))。
選擇120~160 g雄性清潔級(jí)SD大鼠,局麻后無(wú)菌取大網(wǎng)膜,在PBS中洗去紅細(xì)胞,然后用含0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA的PBS液消化(37℃)20~25 min,之后棄去消化液再加入胎牛血清(FBS)終止消化,吹打收集消化下來(lái)的單個(gè)細(xì)胞,4 ℃下離心(800 r/min,5 min),得到細(xì)胞團(tuán),用DMEM/F12培養(yǎng)液(含青、鏈霉素100 U/mL及10%FBS)重懸細(xì)胞,接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液,以后每2~3 d換液1次。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)傳代,用PBS液洗1次后,加0.125%胰蛋白酶2 mL室溫消化3 min,用FBS終止消化,4℃離心,細(xì)胞團(tuán)用DMEM/F12生長(zhǎng)液重懸,以2×106/mL的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液,以后每2~3 d換液1次。第2代被培養(yǎng)的細(xì)胞匯合至90%時(shí)經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察并用細(xì)胞角蛋白抗體及波形蛋白抗體行免疫組化染色鑒定,明確其為PMC,純度達(dá)到99%以上。第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[10]。
第3代腹膜間皮細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)(細(xì)胞數(shù)約為5×106)進(jìn)入實(shí)驗(yàn),用1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h同步化后,隨機(jī)分為下列各組:(1)正常對(duì)照組;(2)脂多糖組:100 μmol/L 作用 48 h;(3)ZnSO4組:30 μmol/L ZnSO4作 用 24 h;(4)ZnSO4/LPS組 :30 μmol/L ZnSO4作用24 h再加100 μmol/L脂多糖作用48 h。脂多糖及ZnSO4的濃度選擇均采用MTT間接法觀察在不同時(shí)間段和不同劑量下殺傷活性的變化篩選,經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)且參照文獻(xiàn)[11]。
RPMCs接種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1 mL培養(yǎng)基,24 h后細(xì)胞貼壁,更換培養(yǎng)液,分別加入100 μmol/L LPS,30 μmol/L ZnSO4,30 μmol/L ZnSO4/100 μmol/L LPS復(fù)合培養(yǎng)48 h后每孔加MTT 10 μL,4 h后,吸凈培養(yǎng)液,加入 DMSO 150 μL,振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD)。
RPMCs轉(zhuǎn)至24孔板,分組處理同前,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,多聚甲醛固定,0.3%Triton?X破膜,BSA室溫孵育30 min。一抗4℃孵育過(guò)夜,羊抗鼠Alexa Fluor 488標(biāo)記熒光二抗室溫下孵育120 min,DAPI染核3~5 min。熒光顯微鏡下觀察α?SMA的表達(dá)。α?SMA蛋白表達(dá)的信號(hào)呈紅色熒光,DAPI呈藍(lán)色熒光。
采用Western印跡法檢測(cè)α?SMA、E?cadherin 、collagenⅠ、Smad2、Smad 3、P?Smad2、P?Smad3蛋白表達(dá)。冰上裂解細(xì)胞,4℃1 000 r/min離心5 min,留取上清用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。總蛋白上樣于12%SDS?PAGE膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,以含5%脫脂奶粉的TBST封閉60 min后,分別加入兔抗大鼠α?SMA、E?cadherin、collagenⅠ和Smad2、Smad 3、P?Smad2、P?Smad3抗體,小鼠抗大鼠β?actin抗體(1∶1 000,北京中杉金橋),4℃過(guò)夜,洗膜,分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 500,北京中杉金橋)、山羊抗小鼠IgG(1∶1 500,北京中杉金橋),室溫孵育2 h,洗膜,ECL發(fā)光法顯影,掃描儀成像,自動(dòng)成像系統(tǒng)分析。
按照TNF?α、TGF?β1 ELISA試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定大鼠腹膜間皮細(xì)胞上清液中TNF?α、TGF?β1的蛋白濃度,450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值,TNF?α、TGF?β1含量計(jì)算結(jié)果以pg/mL表示。
MTT結(jié)果顯示,LPS明顯抑制RPMCs的增殖,而ZnSO4/LPS組的RPMCs的增殖率明顯高于LPS組(圖1)。
圖1 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率Fig.1 Assessment of cell viability by MTT assay
免疫熒光結(jié)果顯示,LPS培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化,由典型的上皮逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形,類似肌成纖維細(xì)胞,而ZnSO4/LPS組細(xì)胞形態(tài)改變明顯減輕。同時(shí)LPS組細(xì)胞的α?SMA熒光強(qiáng)度明顯增加。與此相比,ZnSO4/LPS組的α?SMA熒光強(qiáng)度明顯下降(圖2)。
圖2 α?SMA熒光顯微鏡觀察×200Fig.2 Expression of α?SMA in RPMCs ×200
為了檢測(cè)鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT的影響,我們采用Western blot方法檢測(cè)α?SMA、E?cadherin、collagenⅠ蛋白表達(dá),LPS可導(dǎo)致α?SMA 和collagenⅠ的上調(diào)表達(dá),鋅補(bǔ)充可明顯減少LPS導(dǎo)致的α?SMA和collagenⅠ的上調(diào)表達(dá)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),LPS可下調(diào)E?cadherin的蛋白表達(dá),鋅補(bǔ)充可以明顯逆轉(zhuǎn)LPS引起的E?cadherin蛋白的下調(diào)表達(dá)(圖3)。
圖3 鋅補(bǔ)充對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Zn supplementation on the expression of LPS?induced EMT proteins
與對(duì)照組相比,LPS組大鼠腹膜間皮細(xì)胞TNF?α和TGF?β1表達(dá)顯著升高,與LPS組相比,ZnSO4/LPS組TNF?α和TGF?β1表達(dá)顯著降低(圖4)。
圖4 鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的TNF?α和TGF?β1表達(dá)的影響(ELISA)Fig.4 Effect of Zn ion on the TNF?α and TGF?β1 expression in the LPS?treated RPMCs by ELISA
以往的文獻(xiàn)證實(shí),TGF?β/Smad信號(hào)通路在多種細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2]。我們推測(cè)鋅離子可能通過(guò)此通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組TGF?β/Smad通路關(guān)鍵蛋白Smad2、Smad3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,LPS組細(xì)胞的總Smad2、Smad3表達(dá)沒有明顯改變,而p?Smad2、p?Smad3表達(dá)明顯升高,而鋅補(bǔ)充能夠明顯降低LPS引起的P?Smad2、p?Smad3的上調(diào)表達(dá)。這表明TGF?β/Smad信號(hào)通路在鋅離子介導(dǎo)的RPMCs的阻抑EMT過(guò)程中起到重要作用(圖5)。
圖5 鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的Smad2,Smad 3,P?Smad2,P?Smad 3蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Zn supplementation on the expression of Smad2,Smad 3,P?Smad2 and P?Smad 3 in the LPS?treated RPMCs
腹膜透析是利用腹膜作為半透膜通過(guò)彌散和滲透原理清除機(jī)體內(nèi)代謝廢物和多余的水分,是終末期腎臟病替代治療的主要手段之一。一直認(rèn)為,腹膜組織固有的成纖維細(xì)胞的激活和浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞是引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的最主要因素[12]。然而,近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(EMT)[12]。EMT是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程,在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及一些慢性炎癥疾病纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腹膜間皮細(xì)胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐漸降低的關(guān)鍵因素之一。以往的研究證實(shí),鋅補(bǔ)充能夠抑制或減輕一些動(dòng)物模型的纖維化和臨床上的慢性炎癥疾病,例如肝纖維化、心肌纖維化、血管纖維化以及系統(tǒng)性纖維化等[9]。相反,鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化。文獻(xiàn)證實(shí),終末期腎臟病患者,其中包括血液透析和腹膜透析[7,8]的患者均存在不同程度的鋅缺乏。因此我們有理由推測(cè)鋅離子可能對(duì)腹膜透析相關(guān)的腹膜的纖維化有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中,LPS可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RPMCs發(fā)生EMT,而鋅補(bǔ)充可以有效抑制EMT。此外,鋅補(bǔ)充明顯抑制了TGF?β/Smad信號(hào)通路,其可能是鋅離子產(chǎn)生抗EMT作用的機(jī)制之一。
以往研究表明,多種原因可導(dǎo)致PMCs發(fā)生EMT。例如,以高糖為主的腹透液、TGF?β1、氧化應(yīng)激產(chǎn)物等[13]。RPMCs間存在著多種連接,其中黏合連接的主要結(jié)構(gòu)成分E?cadherin以膜外段與相鄰的細(xì)胞表面同型分子聚合,胞內(nèi)段與膜內(nèi)連環(huán)蛋白(β?catenin)結(jié)合,而連環(huán)蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合錨定微絲束末端于膜內(nèi)面,三者所組成的骨架系統(tǒng)對(duì)維持RPMCs層的完整性至關(guān)重要[1]。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,其中膠原Ⅰ具有代表性,其占成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞合成膠原總量的80%。所以我們選用了collagenⅠ作為觀察的指標(biāo),并檢測(cè)其蛋白水平的變化。本研究通過(guò)免疫熒光檢查顯示,在LPS干預(yù)下,RPMCs中成纖維樣細(xì)胞表型標(biāo)志物α?SMA表達(dá)明顯增加,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)由典型的上皮形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形,類似肌成纖維細(xì)胞。證實(shí)了LPS具有誘導(dǎo)RPMCs發(fā)生EMT的作用。加入Zn?SO4后發(fā)現(xiàn),與LPS組相比,α?SMA熒光強(qiáng)度明顯減弱,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變也明顯減輕,提示ZnSO4具有一定抑制RPMCs的EMT的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)ZnSO4的這種作用,我們采用Western blot方法對(duì)EMT標(biāo)記性蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LPS干預(yù)下,RPMCs的α?SMA 、collagenⅠ蛋白表達(dá)顯著上調(diào),E?cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào);而應(yīng)用ZnSO4后RPMCs上述改變顯著得到抑制,進(jìn)一步表明ZnSO4可以抑制LPS誘導(dǎo)的RPMCs發(fā)生EMT,從而可能抑制LPS誘導(dǎo)的腹膜纖維化的進(jìn)程。
鋅離子具有抑制多種細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而在抗凋亡、抗炎及抗纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。以往的研究證實(shí)鋅離子可以降低由乙醇誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞TGF?β1的高表達(dá)及TGF?β/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活進(jìn)而抑制肝細(xì)胞纖維化的發(fā)生[15]。TGF?β1是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,主要通過(guò)Smad信號(hào)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的胞內(nèi)傳遞。已有許多文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為Smad信號(hào)蛋白在各器官的纖維化中發(fā)揮著重要的作用,如腎、肝、肺、心、皮膚等。最近研究發(fā)現(xiàn)TGF?β1不僅可誘導(dǎo)體外HPMCs發(fā)生EMT而且也可誘導(dǎo)體內(nèi)HPMCs發(fā)生EMT。TGF?β1主要通過(guò) smad 途徑介導(dǎo) EMT[12]。TGF?β1 通過(guò)與TGF?β I型受體結(jié)合進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路。其在EMT中主要的目的基因調(diào)節(jié)依賴于smad2、smad3的轉(zhuǎn) 錄 調(diào)節(jié)。在本研究中,LPS可使 TGF?β1、P?smad2、P?smad3 表達(dá)顯著上調(diào),而加入ZnSO4后,TGF?β1,以及P?smad2、P?smad3蛋白表達(dá)顯著下調(diào),提示ZnSO4具有抑制TGF?β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用,從而可能抑制EMT的發(fā)生和發(fā)展。
本研究結(jié)果顯示,LPS可誘導(dǎo)RPMCs發(fā)生EMT,并促進(jìn)RPMCs致纖維化相關(guān)細(xì)胞因子高表達(dá)。ZnSO4能在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT,這一作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF?β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究將為明確鋅離子在腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化中的作用和相關(guān)機(jī)制,尋找有效干預(yù)腹膜纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與分子靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。
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