鋅離子對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及TGF?β/Smad通路的影響

張秀麗，梁?jiǎn)?，李紅娟，馬健飛，胡曄，樊怡，王力寧

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng)，110001；2.本溪市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 本溪，117000；3.中國(guó)人民解放軍95935部隊(duì)，哈爾濱，150000）

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是慢性腎臟病一體化治療的主要替代治療方法。腹膜纖維化是維持性腹膜透析患者常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，是各種原因引起的腹膜問(wèn)題的最后轉(zhuǎn)歸，是導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)改變和超濾功能喪失，患者退出腹膜透析的主要原因之一［1］。無(wú)論是反復(fù)發(fā)生的腹膜炎，還是非生物相容性的腹膜透析液或者腹透液在加熱處理過(guò)程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，都是引起腹膜纖維化的常見(jiàn)原因［2，3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的裂解成分，是該類(lèi)細(xì)菌的主要致病因素之一。腹膜間皮細(xì)胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）是腹膜發(fā)揮透析作用的主要細(xì)胞群，在調(diào)節(jié)腹膜功能，抑制炎癥和纖維化中起著關(guān)鍵作用［4］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導(dǎo)致PMC發(fā)生向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，是腹膜組織發(fā)生纖維化的早期和可逆階段。大量的研究表明，必需微量元素鋅是機(jī)體多種酶的必需組分或激活因子，參與多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激的作用［5，6］。文獻(xiàn)證實(shí)，終末期腎臟病患者，包括已經(jīng)進(jìn)行血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的鋅缺乏［7，8］。以往的研究證實(shí)，鋅補(bǔ)充能夠抑制或減輕一些動(dòng)物模型和臨床患者的纖維化。相反，鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化［9］。因此我們有理由推測(cè)鋅離子可能對(duì)PMC的EMT有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在研究鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMC的EMT的影響，從而為鋅離子在PD中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量120～160 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

DMEM/F12干粉培養(yǎng)基和胎牛血清（GIBCO，美國(guó)），胰蛋白酶、兔抗大鼠α?SMA、脂多糖粉劑（Sig?ma，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（杭州博日），兔抗大鼠Smad2、Smad3、P?Smad2、P?Smad3、E?cadherin，colla?genⅠ抗體（Santa?Cruz）。TGF?β1 ELISA試劑盒（R﹠D systems，美國(guó)）。

1.3 大鼠腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代與鑒定

選擇120～160 g雄性清潔級(jí)SD大鼠，局麻后無(wú)菌取大網(wǎng)膜，在PBS中洗去紅細(xì)胞，然后用含0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA的PBS液消化（37℃）20～25 min，之后棄去消化液再加入胎牛血清（FBS）終止消化，吹打收集消化下來(lái)的單個(gè)細(xì)胞，4 ℃下離心（800 r/min，5 min），得到細(xì)胞團(tuán)，用DMEM/F12培養(yǎng)液（含青、鏈霉素100 U/mL及10%FBS）重懸細(xì)胞，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)傳代，用PBS液洗1次后，加0.125%胰蛋白酶2 mL室溫消化3 min，用FBS終止消化，4℃離心，細(xì)胞團(tuán)用DMEM/F12生長(zhǎng)液重懸，以2×106/mL的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。第2代被培養(yǎng)的細(xì)胞匯合至90%時(shí)經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察并用細(xì)胞角蛋白抗體及波形蛋白抗體行免疫組化染色鑒定，明確其為PMC，純度達(dá)到99%以上。第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［10］。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

第3代腹膜間皮細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)（細(xì)胞數(shù)約為5×106）進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，用1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h同步化后，隨機(jī)分為下列各組：（1）正常對(duì)照組；（2）脂多糖組：100 μmol/L 作用 48 h；（3）ZnSO4組：30 μmol/L ZnSO4作 用 24 h；（4）ZnSO4/LPS組 ：30 μmol/L ZnSO4作用24 h再加100 μmol/L脂多糖作用48 h。脂多糖及ZnSO4的濃度選擇均采用MTT間接法觀察在不同時(shí)間段和不同劑量下殺傷活性的變化篩選，經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)且參照文獻(xiàn)［11］。

1.5 大鼠腹膜間皮細(xì)胞增殖率測(cè)定

RPMCs接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1 mL培養(yǎng)基，24 h后細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)液，分別加入100 μmol/L LPS，30 μmol/L ZnSO4，30 μmol/L ZnSO4/100 μmol/L LPS復(fù)合培養(yǎng)48 h后每孔加MTT 10 μL，4 h后，吸凈培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)的吸光度值（OD）。

1.6 免疫熒光

RPMCs轉(zhuǎn)至24孔板，分組處理同前，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，多聚甲醛固定，0.3%Triton?X破膜，BSA室溫孵育30 min。一抗4℃孵育過(guò)夜，羊抗鼠Alexa Fluor 488標(biāo)記熒光二抗室溫下孵育120 min，DAPI染核3～5 min。熒光顯微鏡下觀察α?SMA的表達(dá)。α?SMA蛋白表達(dá)的信號(hào)呈紅色熒光，DAPI呈藍(lán)色熒光。

1.7 Western印跡法

采用Western印跡法檢測(cè)α?SMA、E?cadherin 、collagenⅠ、Smad2、Smad 3、P?Smad2、P?Smad3蛋白表達(dá)。冰上裂解細(xì)胞，4℃1 000 r/min離心5 min，留取上清用Bradford法測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘佑?2%SDS?PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉60 min后，分別加入兔抗大鼠α?SMA、E?cadherin、collagenⅠ和Smad2、Smad 3、P?Smad2、P?Smad3抗體，小鼠抗大鼠β?actin抗體（1∶1 000，北京中杉金橋），4℃過(guò)夜，洗膜，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 500，北京中杉金橋）、山羊抗小鼠IgG（1∶1 500，北京中杉金橋），室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光法顯影，掃描儀成像，自動(dòng)成像系統(tǒng)分析。

1.8 ELISA法檢測(cè)上清液TNF?α和TGF?β1的表達(dá)

按照TNF?α、TGF?β1 ELISA試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定大鼠腹膜間皮細(xì)胞上清液中TNF?α、TGF?β1的蛋白濃度，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值，TNF?α、TGF?β1含量計(jì)算結(jié)果以pg/mL表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MTT測(cè)定RPMCs增殖

MTT結(jié)果顯示，LPS明顯抑制RPMCs的增殖，而ZnSO4/LPS組的RPMCs的增殖率明顯高于LPS組（圖1）。

圖1 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率Fig.1 Assessment of cell viability by MTT assay

2.2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

免疫熒光結(jié)果顯示，LPS培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始發(fā)生變化，由典型的上皮逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類(lèi)似肌成纖維細(xì)胞，而ZnSO4/LPS組細(xì)胞形態(tài)改變明顯減輕。同時(shí)LPS組細(xì)胞的α?SMA熒光強(qiáng)度明顯增加。與此相比，ZnSO4/LPS組的α?SMA熒光強(qiáng)度明顯下降（圖2）。

圖2 α?SMA熒光顯微鏡觀察×200Fig.2 Expression of α?SMA in RPMCs ×200

2.3 鋅補(bǔ)充對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的α?SMA 、E?cad?herin、collagenⅠ蛋白表達(dá)的影響

為了檢測(cè)鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT的影響，我們采用Western blot方法檢測(cè)α?SMA、E?cadherin、collagenⅠ蛋白表達(dá)，LPS可導(dǎo)致α?SMA 和collagenⅠ的上調(diào)表達(dá)，鋅補(bǔ)充可明顯減少LPS導(dǎo)致的α?SMA和collagenⅠ的上調(diào)表達(dá)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，LPS可下調(diào)E?cadherin的蛋白表達(dá)，鋅補(bǔ)充可以明顯逆轉(zhuǎn)LPS引起的E?cadherin蛋白的下調(diào)表達(dá)（圖3）。

圖3 鋅補(bǔ)充對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Zn supplementation on the expression of LPS?induced EMT proteins

2.4 鋅補(bǔ)充對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF?α和TGF?β1產(chǎn)生的影響

與對(duì)照組相比，LPS組大鼠腹膜間皮細(xì)胞TNF?α和TGF?β1表達(dá)顯著升高，與LPS組相比，ZnSO4/LPS組TNF?α和TGF?β1表達(dá)顯著降低（圖4）。

圖4 鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的TNF?α和TGF?β1表達(dá)的影響（ELISA）Fig.4 Effect of Zn ion on the TNF?α and TGF?β1 expression in the LPS?treated RPMCs by ELISA

2.5 鋅補(bǔ)充對(duì)LPS誘導(dǎo)的TGF?β/Smad信號(hào)通路的影響

以往的文獻(xiàn)證實(shí)，TGF?β/Smad信號(hào)通路在多種細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［2］。我們推測(cè)鋅離子可能通過(guò)此通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組TGF?β/Smad通路關(guān)鍵蛋白Smad2、Smad3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞的總Smad2、Smad3表達(dá)沒(méi)有明顯改變，而p?Smad2、p?Smad3表達(dá)明顯升高，而鋅補(bǔ)充能夠明顯降低LPS引起的P?Smad2、p?Smad3的上調(diào)表達(dá)。這表明TGF?β/Smad信號(hào)通路在鋅離子介導(dǎo)的RPMCs的阻抑EMT過(guò)程中起到重要作用（圖5）。

圖5 鋅離子對(duì)LPS誘導(dǎo)的Smad2，Smad 3，P?Smad2，P?Smad 3蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Zn supplementation on the expression of Smad2，Smad 3，P?Smad2 and P?Smad 3 in the LPS?treated RPMCs

3 討論

腹膜透析是利用腹膜作為半透膜通過(guò)彌散和滲透原理清除機(jī)體內(nèi)代謝廢物和多余的水分，是終末期腎臟病替代治療的主要手段之一。一直認(rèn)為，腹膜組織固有的成纖維細(xì)胞的激活和浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞是引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的最主要因素［12］。然而，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（EMT）［12］。EMT是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及一些慢性炎癥疾病纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腹膜間皮細(xì)胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐漸降低的關(guān)鍵因素之一。以往的研究證實(shí)，鋅補(bǔ)充能夠抑制或減輕一些動(dòng)物模型的纖維化和臨床上的慢性炎癥疾病，例如肝纖維化、心肌纖維化、血管纖維化以及系統(tǒng)性纖維化等［9］。相反，鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化。文獻(xiàn)證實(shí)，終末期腎臟病患者，其中包括血液透析和腹膜透析［7，8］的患者均存在不同程度的鋅缺乏。因此我們有理由推測(cè)鋅離子可能對(duì)腹膜透析相關(guān)的腹膜的纖維化有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中，LPS可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RPMCs發(fā)生EMT，而鋅補(bǔ)充可以有效抑制EMT。此外，鋅補(bǔ)充明顯抑制了TGF?β/Smad信號(hào)通路，其可能是鋅離子產(chǎn)生抗EMT作用的機(jī)制之一。

以往研究表明，多種原因可導(dǎo)致PMCs發(fā)生EMT。例如，以高糖為主的腹透液、TGF?β1、氧化應(yīng)激產(chǎn)物等［13］。RPMCs間存在著多種連接，其中黏合連接的主要結(jié)構(gòu)成分E?cadherin以膜外段與相鄰的細(xì)胞表面同型分子聚合，胞內(nèi)段與膜內(nèi)連環(huán)蛋白（β?catenin）結(jié)合，而連環(huán)蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合錨定微絲束末端于膜內(nèi)面，三者所組成的骨架系統(tǒng)對(duì)維持RPMCs層的完整性至關(guān)重要［1］。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其中膠原Ⅰ具有代表性，其占成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞合成膠原總量的80%。所以我們選用了collagenⅠ作為觀察的指標(biāo)，并檢測(cè)其蛋白水平的變化。本研究通過(guò)免疫熒光檢查顯示，在LPS干預(yù)下，RPMCs中成纖維樣細(xì)胞表型標(biāo)志物α?SMA表達(dá)明顯增加，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)由典型的上皮形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類(lèi)似肌成纖維細(xì)胞。證實(shí)了LPS具有誘導(dǎo)RPMCs發(fā)生EMT的作用。加入Zn?SO4后發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比，α?SMA熒光強(qiáng)度明顯減弱，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變也明顯減輕，提示ZnSO4具有一定抑制RPMCs的EMT的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)ZnSO4的這種作用，我們采用Western blot方法對(duì)EMT標(biāo)記性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LPS干預(yù)下，RPMCs的α?SMA 、collagenⅠ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，E?cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)；而應(yīng)用ZnSO4后RPMCs上述改變顯著得到抑制，進(jìn)一步表明ZnSO4可以抑制LPS誘導(dǎo)的RPMCs發(fā)生EMT，從而可能抑制LPS誘導(dǎo)的腹膜纖維化的進(jìn)程。

鋅離子具有抑制多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而在抗凋亡、抗炎及抗纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14］。以往的研究證實(shí)鋅離子可以降低由乙醇誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞TGF?β1的高表達(dá)及TGF?β/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活進(jìn)而抑制肝細(xì)胞纖維化的發(fā)生［15］。TGF?β1是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要通過(guò)Smad信號(hào)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的胞內(nèi)傳遞。已有許多文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為Smad信號(hào)蛋白在各器官的纖維化中發(fā)揮著重要的作用，如腎、肝、肺、心、皮膚等。最近研究發(fā)現(xiàn)TGF?β1不僅可誘導(dǎo)體外HPMCs發(fā)生EMT而且也可誘導(dǎo)體內(nèi)HPMCs發(fā)生EMT。TGF?β1主要通過(guò) smad 途徑介導(dǎo) EMT［12］。TGF?β1 通過(guò)與TGF?β I型受體結(jié)合進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路。其在EMT中主要的目的基因調(diào)節(jié)依賴(lài)于smad2、smad3的轉(zhuǎn) 錄 調(diào)節(jié)。在本研究中，LPS可使 TGF?β1、P?smad2、P?smad3 表達(dá)顯著上調(diào)，而加入ZnSO4后，TGF?β1，以及P?smad2、P?smad3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示ZnSO4具有抑制TGF?β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，從而可能抑制EMT的發(fā)生和發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)RPMCs發(fā)生EMT，并促進(jìn)RPMCs致纖維化相關(guān)細(xì)胞因子高表達(dá)。ZnSO4能在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT，這一作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF?β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究將為明確鋅離子在腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化中的作用和相關(guān)機(jī)制，尋找有效干預(yù)腹膜纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與分子靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。

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