骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向人膠質(zhì)瘤遷移的分子機(jī)制初探

胡宜，程鵬，薛一雪，劉云會(huì)

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110001；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽110001）

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，極易復(fù)發(fā)［1］。膠質(zhì)瘤患者接受外科手術(shù)切除后，平均生存期限僅為6個(gè)月，2年生存率不足7.5%［2］。近年來，針對膠質(zhì)瘤的細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因以及調(diào)節(jié)蛋白的靶向基因治療受到關(guān)注［3］。在其靶向治療中，尋找能將治療藥物或基因運(yùn)送到腫瘤部位的載體很重要。目前，存在于骨髓中的非造血性干細(xì)胞——骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow?derived mesenchymal stem cells，BMSCs），因其具有向膠質(zhì)瘤的趨化遷移能力而引起人們的注意［4～6］。該特性使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為膠質(zhì)瘤基因治療的合適載體。然而，BMSCs向膠質(zhì)瘤定向遷移的機(jī)制仍不明確，探明其向膠質(zhì)瘤趨化的分子生物學(xué)機(jī)制有助于提高BM?SCs的遷移效率，為進(jìn)一步合理的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

目前，在BMSCs向膠質(zhì)瘤遷移的機(jī)制研究中，多認(rèn)為腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種趨化因子吸引其遷移。然而涉及BMSCs表面標(biāo)志物及其下游信號通路的研究非常有限。本研究通過調(diào)查膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BMSCs表面黏附分子——血管細(xì)胞黏附分子?1（vascular cell adhesion molecule?1，VCAM?1）表達(dá)的影響及其在BMSCs向膠質(zhì)瘤遷移過程中的作用以及下游信號傳導(dǎo)通路，探討B(tài)MSCs向膠質(zhì)瘤趨化遷移分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Dulbecco′s modified Eagle medium（DMEM）低糖培養(yǎng)基及優(yōu)級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，小鼠抗大鼠VCAM?1單克隆阻滯抗體（MMS?141P）購買于美國Covance公司。Trizol試劑購自加拿大Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自TaKaRa生物科技公司［RNA PCR Kit（AMV）ver 3.0］。兔抗大鼠VCAM?1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。Radio immunoprecipitation assay（RIPA）裂解液及BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司。羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗購于美國Santa Cruz公司。吉姆薩染液購自北京索萊寶科技有限公司。磷脂酰肌醇?3?激酶（phosphoinositide?3?kinase，PI3K）信號通路抑制劑LY294002購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)［7，8］。取材對象為 4～6 周齡健康 Sprague?Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量60～80 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。脫頸處死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5 min，超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨，剪去骨骺端，以含10%血清的DMEM低糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔3次。以1 mL注射器針頭過濾，吹打成單細(xì)胞懸液并接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的75 cm2培養(yǎng)瓶中，在含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后每72 h換液。12～14 d后，細(xì)胞生長至80%～90%融合，以0.25%胰酶消化，然后以1∶2傳代，之后約5～7 d再次傳代，使用第2～4代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞株采用人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，由中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，條件同樣為37℃，5%CO2。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移模型的建立

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移模型利用24孔板、Transwell小室（聚碳酸酯膜，孔徑為8μm，型號3422，購自Coning Costar公司）。分為實(shí)驗(yàn)組，VCAM?1阻斷組及對照組。實(shí)驗(yàn)組中人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞以無血清L?DMEM培養(yǎng)基重懸，將5×105/mL密度的U251細(xì)胞懸液0.5 mL接種于24孔板小孔內(nèi)。培養(yǎng)4 h后，待U251細(xì)胞完全貼壁后，Transwell小室內(nèi)接種密度為1×106/mL的BMSCs懸液0.2 mL，培養(yǎng)24 h。對照組的24孔板小孔內(nèi)放置同體積的不含細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。VCAM?1阻斷組則在上室加入VCAM?1特異性阻斷單克隆抗體（Covance，10 μg/mL）或磷脂酰肌醇?3?激酶（PI3K）信號通路抑制劑 LY294002（10 μmol/L）。培養(yǎng) 24 h后，取出Transwell小室，用無菌棉棒輕擦去聚碳酸酯膜上表面的細(xì)胞，利用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solu?tion，PBS）漂洗1次，甲醇∶冰乙酸（3∶1）固定30 min，吉姆薩染液（工作液∶稀釋液為9∶1）染色15 min。甩去染液，自來水沖洗2次，光鏡下觀察計(jì)數(shù)遷移到聚碳酸酯膜下表面的細(xì)胞。每組6孔，每孔計(jì)數(shù)6個(gè)隨機(jī)400×視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，然后遷移能力以遷移指數(shù)（migration index）表示［9］。所得數(shù)據(jù)采用±s表示。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR）

第三代培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞在U251細(xì)胞上清中培養(yǎng)24 h。加入LY294002（30 μmol/L）。無血清培養(yǎng)基作為對照組。總RNA按照說明書，利用Trizol提取。cDNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用TaKaRa的PCR Kit（AMV）ver 3.0，加入500 ng的總RNA。PCR采用的引物序列為 5′?ACACCTCCCCCAAGAATACAG?3′（forward）和5′?GC TCATCCTCAACACCCACAG?3′（reverse），擴(kuò)增片段長度為477 bp。PCR反應(yīng)條件體系為94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min。進(jìn)行32次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物采用含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外線下發(fā)光，并計(jì)算目的基因與β?actin的積分光密度比值并進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)。

1.5 蛋白印跡（Western blot）

BMSCs以預(yù)先冰冷的PBS沖洗3次，然后利用細(xì)胞刮刀收集于離心管中，加入適量RIPA裂解液（碧云天），冰上裂解30 min，然后超聲粉碎。4℃條件下以14 000 g離心5 min，含有蛋白的上清被收集到新管中。利用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為25 μg，利用10%SDS?polyacrylamide gel electro?phoresis（PAGE）凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。轉(zhuǎn)膜后以兔抗大鼠的VCAM?1多克隆抗體及小鼠抗大鼠β?actin多克隆抗體封閉過夜。山羊抗小鼠及抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，利用ChemiImager 5500 V2.03軟件檢測，并測定積分光密度值，計(jì)算目的基因與β?actin的積分光密度相對比值并進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（版本為13.0）進(jìn)行，并經(jīng)過配對t檢驗(yàn)驗(yàn)證；多組間差異經(jīng)過Bonferroni檢驗(yàn)，均計(jì)算P值。以P＆lt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

原代取材3 d后即可觀察到貼壁細(xì)胞。5 d形成集落（圖1A）。12～14 d生長至80%～90%融合，呈旋渦狀、鋪路石狀（圖1B）。傳代后大約5～7 d再次生長至90%融合，可進(jìn)行再次傳代。吉姆薩染色下顯示第3代BMSCs細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈有突起的長梭型（圖1C）。

圖1 BMSCs形態(tài)Fig.1 The morphology of BMSCs

2.2 VCAM?1及PI3K信號通路在BMSCs向人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移中發(fā)揮作用

與對照組相比，在Transwell體外遷移系統(tǒng)中，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞強(qiáng)烈的吸引BMSCs的遷移（圖2A，2B）。加入VCAM?1特異性阻斷單克隆抗體后，與U251組相比，發(fā)生遷移的BMSCs細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖2C），遷移的細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2E）（P＆lt;0.05）。為了進(jìn)一步探明BMSCs發(fā)生遷移的信號傳導(dǎo)機(jī)制，加入了PI3K信號通路抑制劑LY294002。結(jié)果顯示與U251組相比，遷移到半透膜下表面的BMSCs細(xì)胞數(shù)量同樣明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2E）（P＆lt;0.05）。

圖2 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs的遷移被VCAM?1阻滯抗體及LY294002抑制Fig.2 U251 glioma cells induced migration of BMSCs was impaired by blocking antibody against VCAM?1 and LY294002

2.3 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞上調(diào)BMSCs的VCAM?1核酸及蛋白表達(dá)

利用RT?PCR及Western blot方法檢測U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BMSCs的VCAM?1核酸及蛋白的表達(dá)影響。RT?PCR結(jié)果顯示：與無血清對照組相比，U251細(xì)胞上清顯著增強(qiáng)了BMSCs的VCAM?1的mRNA表達(dá)（圖3A）。Western blot結(jié)果同樣顯示，在U251細(xì)胞培養(yǎng)上清的誘導(dǎo)下，BMSCs的VCAM?1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯升高（圖3B），表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。

圖3 PI3K信號通路在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)控BMSCs的VCAM?1表達(dá)中的作用Fig.3 The role of PI3K pathway in the regulation of VCAM?1 expression on BMSCs by U251 glioma cells.

2.4 PI3K信號通路調(diào)控BMSCs的VCAM?1表達(dá)

為了探明U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BMSCs的VCAM?1表達(dá)調(diào)控中的信號傳導(dǎo)通路，在U251細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的同時(shí)加入PI3K通路抑制劑LY294002（30μ mol/L）。結(jié)果顯示，加入LY294002后，被膠質(zhì)瘤細(xì)胞上調(diào)的VCAM?1蛋白質(zhì)及核酸表達(dá)均受到顯著抑制（圖3A、3B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）（P＆lt;0.05）。

3 討論

本研究首先成功分離并以全骨髓法培養(yǎng)BM?SCs，結(jié)果顯示其易于體外擴(kuò)增，細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈典型的集落樣生長，形態(tài)符合文獻(xiàn)中報(bào)道［6］。我們的研究首先證實(shí)BMSCs在體外具有向人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的能力，然后觀察到U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs遷移可被VCAM?1特異性單克隆阻斷抗體或PI3K信號通路抑制劑LY294002所抑制，明確了細(xì)胞表面粘附分子VCAM?1以及PI3K信號通路在BMSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移中發(fā)揮作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可顯著上調(diào)BMSCs的VCAM?1核酸及蛋白表達(dá)，而PI3K信號通路抑制劑LY294002可抑制VCAM?1的表達(dá)上調(diào)及BMSCs的遷移能力。以上結(jié)果說明膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能通過促進(jìn)BMSCs表達(dá)細(xì)胞表面粘附分子而誘導(dǎo)其遷移，同時(shí)在這一過程中PI3K信號通路發(fā)揮作用。

由于膠質(zhì)瘤的惡性浸潤性生長方式，傳統(tǒng)的腫瘤全切以及術(shù)后放化療等仍無法完全根除并防止其復(fù)發(fā)。在此背景下，基因靶向治療成為熱點(diǎn)。BMSCs是來自于中胚層、存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，除多向分化潛能外，還具有免疫調(diào)節(jié)活性［10，11］。另一方面，BMSCs向腫瘤的趨向遷移已引起人們的關(guān)注［12，13］。有學(xué)者認(rèn)為，BMSCs向腫瘤的趨向性具有特異性及普遍性，是其作為干細(xì)胞的一個(gè)內(nèi)在特點(diǎn)［14］。BMSCs容易分離提取，體外培養(yǎng)擴(kuò)增方便，具有高度可塑性，免疫相容性好，被認(rèn)為是組織工程和細(xì)胞移植治療中的理想細(xì)胞［15］。利用BMSCs的向腫瘤的趨化特性，將基因轉(zhuǎn)換技術(shù)及細(xì)胞移植結(jié)合起來，有可能使其成為理想的基因治療載體。然而BMSCs的這種向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移特性的機(jī)制目前仍不明確。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種與炎性細(xì)胞趨化相關(guān)的細(xì)胞因子，如內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等［16］。生長因子類對BMSCs有較強(qiáng)趨化作用，例如血小板源性生長因子?BB是較強(qiáng)烈吸引BMSCs遷移的因子［4］。但目前關(guān)于BMSCs本身及細(xì)胞標(biāo)志物、受體及下游信號通路在其向膠質(zhì)瘤的遷移中的變化，則未見報(bào)道。

黏附分子是一類重要的糖蛋白，介導(dǎo)白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附及遷移。目前，對BMSCs的細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)情況研究很少。作為一類重要的細(xì)胞表面黏附分子，VCAM?1參與調(diào)節(jié)白細(xì)胞向微血管內(nèi)皮的遷移及附著［17，18］。有研究指出VCAM?1 及其受體α4β1 整合素表達(dá)于 BMSCs［19，20］，同時(shí)VCAM?1在BMSCs向心血管內(nèi)皮的遷移中也發(fā)揮作用［21］。因此我們推測在BMSCs向人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移中，VCAM?1同樣可能發(fā)揮作用。在體外遷移模型中，Transwell上室內(nèi)加入濃度為10 μg/mL的VCAM?1特異性單克隆阻滯抗體后，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞引起的BMSCs遷移數(shù)量明顯減少，說明阻滯VCAM?1后BMSCs的向膠質(zhì)瘤遷移能力顯著減弱。在此基礎(chǔ)上，我們又進(jìn)一步研究了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BMSCs的VCAM?1表達(dá)調(diào)控。RT?PCR及Western blot研究結(jié)果顯示，U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)可顯著促進(jìn)BMSCs的VCAM?1 mRNA及蛋白的表達(dá)。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide?3?ki?nase，PI3K）信號通路在細(xì)胞存活、增殖、趨化等重要的細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮作用，并與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［22，23］。Forte等［24］報(bào)道PI3K與肝細(xì)胞生長因子介導(dǎo)的BMSCs遷移有關(guān)。另有報(bào)道指出PI3K通路參與人類內(nèi)皮細(xì)胞的VCAM?1表達(dá)調(diào)控［26，25］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PI3K信號通路抑制劑LY294002明顯抑制BMSCs向U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)可以抑制被膠質(zhì)瘤細(xì)胞上調(diào)的黏附分子的mRNA及蛋白表達(dá)，說明在膠質(zhì)瘤調(diào)控BMSCs的VCAM?1表達(dá)過程中PI3K信號通路發(fā)揮重要作用。

上述結(jié)果表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用下BMSCs可能通過上調(diào)表達(dá)細(xì)胞表面黏附分子VCAM?1而促進(jìn)其向膠質(zhì)瘤定向遷移，并且在該過程中的下游信號傳導(dǎo)通路為PI3K信號通路，這可能是BMSCs向腫瘤的趨化遷移的機(jī)制之一。

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