豬腎細(xì)胞感染豬偽狂犬病毒后的細(xì)胞觀察與分析

毛 凝，鄭 敏，黃梅清，陳少鶯

（福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350003）

流式細(xì)胞儀是采用流式細(xì)胞術(shù)在功能水平上對(duì)單個(gè)細(xì)胞或者其他生物粒子懸液進(jìn)行定量分析和分選的自動(dòng)化分析儀器，以獲得其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、DNA、RNA及抗原等物理及化學(xué)特性。流式細(xì)胞儀具有操作簡(jiǎn)單、分析快速精準(zhǔn)、重復(fù)性好、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛使用于檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和免疫效果檢測(cè)等方面［1－5］。

豬偽狂犬病毒是皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科的成員，可引起豬繁殖障礙綜合癥、仔豬腦脊髓炎，仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、衰竭而死，成年豬一般表現(xiàn)為隱形感染，生長(zhǎng)發(fā)育受阻并伴隨呼吸道癥狀。目前，豬偽狂犬病在全世界50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道，已給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失?，F(xiàn)在，實(shí)驗(yàn)室常用于診斷豬偽狂犬病毒的方法有ELISA和PCR，均只對(duì)豬偽狂犬病毒的感染進(jìn)行定性和定量分析，對(duì)細(xì)胞確切的變化缺乏微觀分析，而利用流式細(xì)胞儀則可對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞水平的分析［6－9］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 豬腎細(xì)胞 （PK細(xì)胞）和豬偽狂犬病毒株，由福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疾病防控工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑、試劑盒 培養(yǎng)基1640、胰酶（GIBCO、0.25%）、小牛血清（?？寺」荆?、PBS（?？寺」荆?、RNase A （凱基生物）、碘化丙啶 （凱基生物）；細(xì)胞周期試劑盒 （KGA512）、細(xì)胞凋亡試劑盒 （KGA107），均有凱基生物提供；流式細(xì)胞儀 （BD生物科學(xué)）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬腎細(xì)胞培養(yǎng)和處理 （1）豬腎細(xì)胞體外培養(yǎng)。豬腎細(xì)胞采用傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法：在含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好、鋪滿培養(yǎng)瓶瓶壁時(shí)，用胰酶消化傳代，選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，換入1%小牛血清的維持液，加入100μL豬偽狂犬病毒，顯微鏡觀察試驗(yàn)組細(xì)胞發(fā)生70%肉眼可見病變時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化。對(duì)照組為未加入豬偽狂犬病毒的細(xì)胞組，與試驗(yàn)組細(xì)胞同步消化，各組細(xì)胞濃度為5×105mol/L。（2）細(xì)胞收集。消化后的細(xì)胞平均分為3份，1000r/min離心5 min，棄去上清，PBS （0.01mol/L）重懸，重復(fù)2次。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測(cè) （1）收集的細(xì)胞懸液用70%的乙醇固定，4℃保存2h，染色前用PBS（0.01mol/L）洗去固定液； （2）加入100μL RNase A，37℃水浴30min；（3）加入400μL PI染色均勻，4℃避光30min；（4）上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) （1）收集的細(xì)胞懸液，2000r/min離心5min； （2）用 PBS （0.01mol/L）洗滌細(xì)胞2次 （2000r/min離心5min）； （3）加入500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞；（4）加入5 μL Annexin V－FITC混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻； （5）室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；（6）6h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和接毒

加入豬偽狂犬病毒前，豬腎細(xì)胞排列緊密，單層鋪滿，細(xì)胞呈近圓形 （圖1）；加入豬偽狂犬病毒后48h，顯微鏡觀察出現(xiàn)空斑病變，細(xì)胞皺縮、變小，界限模糊 （圖2）。

圖1 正常傳代培養(yǎng)的豬腎細(xì)胞

2.2 細(xì)胞周期檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，處理前細(xì)胞多處于DNA合成期 （S）（圖3）；處理后的細(xì)胞大多處在DNA合成前期 （G1）（圖4）。說明細(xì)胞大多被阻滯在細(xì)胞分裂的DNA合成前期，而沒有進(jìn)入細(xì)胞分裂間期。

圖2 接毒后48h豬腎細(xì)胞出現(xiàn)可見病變

圖3 正常細(xì)胞周期圖

圖4 處理后細(xì)胞周期圖

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

試驗(yàn)顯示，正常細(xì)胞出現(xiàn)在左下角，顯示PI和FITC染色雙陰性 （圖5）；處理后的細(xì)胞集中在右下角，PI染色陰性而FITC染色陽(yáng)性，提示細(xì)胞處于凋亡后期 （圖6）。

圖5 正常細(xì)胞凋亡

圖6 處理后細(xì)胞凋亡

3 討論

細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過程。通過細(xì)胞周期，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)開始復(fù)制并加倍，在分裂結(jié)束時(shí)平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。細(xì)胞周期分為細(xì)胞間期和有絲分裂期，細(xì)胞間期常劃分為休眠期G0、DNA合成前期G1、DNA合成期S、DNA合成后期G2。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料碘化丙啶 （propidine iodide，PI）結(jié)合的特性進(jìn)行檢測(cè)，即細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的DNA含量不同，其與熒光染料的結(jié)合情況也不同，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的熒光強(qiáng)度也不一樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒感染后，細(xì)胞大部分停滯在DNA合成前期而沒有繼續(xù)進(jìn)入DNA合成期，即細(xì)胞沒有進(jìn)入正常的細(xì)胞周期，進(jìn)而出現(xiàn)凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或者病理?xiàng)l件下，按照自身的規(guī)律，啟動(dòng)內(nèi)部機(jī)制來結(jié)束自己生命的過程，即細(xì)胞在基因控制下的程序性死亡，是機(jī)體維持自身內(nèi)穩(wěn)定的基本生理功能。本研究采用Annexin－FTIC和PI為雙熒光探針，Annexin－FTIC/PI法是流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡常用的方法之一。正常細(xì)胞膜磷脂的分布是不對(duì)稱的，膜內(nèi)表面含負(fù)電的磷脂 （如磷脂酰絲酸，PS），而膜外表面含有占絕大多數(shù)的中性磷脂。在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V是一種分子量為35×103～36×103的Ca2＋依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin V進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記即能檢測(cè)到細(xì)胞早期凋亡。碘化丙啶 （propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完好的對(duì)PI有拒染性，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來［10－12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒感染后的細(xì)胞在雙參數(shù)流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限為正常細(xì)胞，即 （FITC–/PI－）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC＋/PI＋）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC＋/PI－）。

綜上所述，豬偽狂犬病毒感染豬腎細(xì)胞影響了細(xì)胞的正常周期，大部分細(xì)胞被阻滯在DNA合成前期無法進(jìn)入下一步程序；細(xì)胞進(jìn)而出現(xiàn)大量的凋亡，既而形成了顯微鏡可見的空斑。

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