左卡尼汀通過抑制鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ信號通路抑制過氧化氫誘導的大鼠心肌細胞凋亡*

戴紅良， 賈桂枝， 劉 堃， 梁春光， 張 林， 張志剛， 王洪新

(遼寧醫(yī)學院1護理學院，2生物化學與分子生物學教研室，4藥理學教研室，遼寧錦州121001;3聊城市人民醫(yī)院藥學部，山東聊城252600)

氧化應激在缺血再灌注損傷、高血壓、糖尿病等疾病所致心肌損害中具有重要作用。異常的氧化應激水平可誘發(fā)炎癥反應，引起細胞凋亡增加，最終引起心肌重構及充血性心力衰竭［1-2］。鑒于此，阻止氧化應激和對抗細胞凋亡為臨床治療各種心血管疾病提供了重要思路。左卡尼汀又稱左旋肉堿，其基本功能是將長鏈脂肪酸轉運至線粒體機制，促進其氧化分解，是哺乳動物體內(nèi)參與能量代謝的重要物質［3］。除此之外，左卡尼汀還具有顯著的抗氧化及抗凋亡活性［4］。我們最近的研究也發(fā)現(xiàn)左卡尼汀能夠顯著抑制由過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)刺激引起的體外心肌細胞凋亡［5］，然而對于其確切機制卻知之甚少。本研究擬在我們前期研究的基礎上，進一步探討左卡尼汀的抗凋亡作用機制。

材料和方法

1 材料

1．1 藥物與試劑 胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、DMEM低糖培養(yǎng)基、二甲基亞砜、MTT、左卡尼汀、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，BAPTA］及KN93均購于Sigma;annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司;Fluo-3/AM購自江蘇碧云天;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)蛋白定量試劑盒購自Pierce;cleaved caspase-3 I抗購于Cell Signaling;鈣調(diào)素依賴蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)I 抗購自Santa Cruz;磷酸化 CaMKⅡ (phospho-CaMKⅡ，p-CaMKⅡ)購自 Promega;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)I抗購于Sigma;辣根過氧化物酶(horseradish peroxide，HRP)標記的II抗購于Santa Cruz。

1．2 動物 出生1～3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物合格證號為SCXK(遼)2003-0007。

2 方法

2．1 心肌細胞培養(yǎng) 新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法，參照文獻［5］。取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，在37℃條件下，以0．8 g/L胰蛋白酶消化分離細胞。將消化完畢的細胞以差速貼壁法進行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合后，換以含0．04%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細胞分組用于實驗。

2．2 實驗分組 將體外培養(yǎng)的SD大鼠心肌細胞隨機分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼汀(1．2 mmol/L)+H2O2組、BAPTA(細胞內(nèi)鈣離子絡合劑，20μmol/L)+H2O2組和KN93(CaMKII特異性抑制劑，0．2 μmol/L)+H2O2組。H2O2濃度為200 μmol/L，作用時間為12 h。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入，BAPTA及KN93于加入H2O230 min前加入。左卡尼汀、BAPTA及KN93均維持至H2O2處理結束。

2．3 心肌細胞活力檢測 采用MTT法測定心肌細胞活力。將接種于96孔培養(yǎng)板，處理完畢后的心肌細胞用于實驗。在測試前4 h，每孔加入0．5 g/L MTT，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜100μL，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度(A)，該值間接反映細胞活力的高低。

2．4 心肌細胞凋亡測定 采用流式細胞術進行檢測，將經(jīng)過處理的心肌細胞用1．25 g/L胰蛋白酶消化分離，調(diào)節(jié)細胞密度為1×109/L后，按照annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。

2．5 心肌細胞內(nèi)靜息鈣濃度(［Ca2+］i)測定 細胞用D-Hanks液洗3次，用5μmol/L Fluo-3/AM 37℃避光孵育45 min，然后吸出染液，再以D-Hanks液洗滌3次，每孔加入0．5 mL D-Hanks液。將激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿置于LSCM 570載物臺上，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，記錄細胞內(nèi)熒光強度并由計算機軟件進行處理。以細胞內(nèi)熒光強度間接反映細胞內(nèi)靜息鈣離子水平。指定對照組熒光強度為1，以其它組與對照組的比值反映各組的相對熒光強度。

2．6 Cleaved caspase-3和 p-CaMKII表達 收集細胞，加細胞裂解液 RIPA［1%乙基苯基聚乙二醇(nonidet P-40，NP-40)，0．5% 脫氧膽酸鈉，1% 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，0．1% 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)］提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5 min后置10%SDSPAGE中進行電泳，待電泳完成后電轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，接著加 cleaved caspase-3、p-CaMKII、CaMKII及GAPDHⅠ抗4℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色。用ImageJ 1．42軟件對掃描的條帶進行灰度分析。指定對照組蛋白表達為1，以其它組與對照組的比值反映各組的相對蛋白表達。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 左卡尼汀、BAPTA及KN93對大鼠心肌細胞活力的影響

與正常組比較，H2O2組大鼠心肌細胞活力顯著降低。而與模型組比較，左卡尼汀、BAPTA及KN93預處理組心肌細胞活力則顯著增加，見圖1。

2 左卡尼汀、BAPTA及KN93對大鼠心肌細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，H2O2處理12 h后大鼠心肌細胞凋亡顯著增加。與H2O2組相比左卡尼汀、BAPTA及KN93預處理組心肌細胞凋亡率均顯著降低;利用Western blotting檢測cleaved caspase-3(代表凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活性)的表達，也得到了類似的結果，見圖2、3。

Figure 1．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on decreased cell viability induced by H2O2 in rat cardiomyocyte．Mean±SD．n=6．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs H2 O2 alone．圖1 左卡尼汀、BAPTA及KN93對H 2 O 2誘導的大鼠心肌細胞活力降低的影響

Figure 2．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2 O2-triggered apoptosis of rat cardiomyocytes．Mean ± SD．n=5．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs H2O2 alone．圖2 左卡尼汀、BAPTA及KN93對H 2 O2誘導的大鼠心肌細胞凋亡的影響

Figure 3．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2O2-triggered caspase-3 activation in rat cardiomyocytes．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs control;#P＜0．05 vs H2 O2 alone．圖3 左卡尼汀、BAPTA及KN93對H 2O2誘導的大鼠心肌細胞內(nèi)caspase-3活化的影響

3 左卡尼汀、BAPTA及KN93對大鼠心肌細胞內(nèi)靜息鈣的影響

與正常組比較，H2O2處理12 h后大鼠心肌細胞內(nèi)靜息鈣離子水平顯著增加。左卡尼汀和BAPTA均能顯著降低H2O2處理組心肌細胞內(nèi)的靜息鈣水平。而KN93對H2O2誘導的靜息鈣增加無顯著影響，見圖4。

Figure 4．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2O2-triggered elevation of resting intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in rat cardiomyocytes．Mean±SD．n=120．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2 alone．圖4 左卡尼汀、BAPTA及KN93對H 2 O2誘導的大鼠心肌細胞內(nèi)靜息鈣升高的影響

4 左卡尼汀、BAPTA及KN93對大鼠心肌細胞內(nèi)CaMKII磷酸化的影響

與正常組比較，H2O2處理12 h后大鼠心肌細胞內(nèi)磷酸化CaMKII(p-CaMKII)水平顯著升高。左卡尼汀、BAPTA及KN93預處理不同程度抑制CaMKII的磷酸化，見圖5。

Figure 5．Effects of L-carnitine，BAPTA and KN93 on H2 O2-triggered CaMKII activation in rat cardiomyocytes．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs H2 O2 alone．圖5 左卡尼汀、BAPTA及KN93對H 2 O 2誘導的大鼠心肌細胞內(nèi)CaMKII活化的影響

討 論

氧化應激系指細胞中的促氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導致氧化作用過度增強而引起的一種細胞內(nèi)的紊亂狀態(tài)。心肌受到損傷后，活性氧與自由基生成大大增加。已經(jīng)證實，氧化應激在心肌缺血再灌注損傷、充血性心力衰竭及乙醛中毒等病理過程中發(fā)生的細胞凋亡有著密不可分的關系［6-8］。而應用抗氧化劑往往能夠抑制該過程［9］。

左卡尼汀具有顯著的抗氧化活性。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)左卡尼汀能顯著改善活性氧物質H2O2誘導的心肌細胞內(nèi)氧化應激及凋亡。利用鈣瞬變技術，我們認為該抗凋亡作用可能與左卡尼汀改善細胞內(nèi)的鈣紊亂有關［5］。由于上述鈣離子測定是在急性條件下進行的(H2O2最長刺激5 min)，用其解釋慢性刺激后的凋亡尚具有一定的局限性。為此，為進一步證實左卡尼汀的抗凋亡活性確實與其抑制細胞內(nèi)Ca2+超載有關，我們在本實驗中運用了激光共聚焦技術，同步測量細胞凋亡與細胞內(nèi)靜息Ca2+濃度(H2O2刺激12 h)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BAPTA(Ca2+螯合劑)預處理可明顯抑制H2O2刺激誘導的心肌細胞凋亡，表明Ca2+超載是H2O2誘發(fā)心肌細胞凋亡的重要機制。而左卡尼汀在抑制細胞凋亡的同時，還可顯著降低心肌細胞內(nèi)的靜息鈣水平。充分說明，糾正心肌細胞內(nèi)鈣超載是左卡尼汀發(fā)揮其抗H2O2所致細胞凋亡的重要機制。

作為細胞內(nèi)重要的鈣離子調(diào)節(jié)蛋白，CaMKII活化在心肌細胞凋亡中起著至關重要的作用［10］。在本實驗中用特異性抑制劑KN93阻斷CaMKII后，H2O2誘發(fā)心肌細胞凋亡明顯降低。說明CaMKII活化也參與了H2O2誘導的心肌凋亡。而且，左卡尼汀預處理能顯著降低CaMKII的磷酸化(活化)，表明左卡尼汀的抗凋亡活性可能與其抑制CaMKII的活化有關。

目前共發(fā)現(xiàn)α、β、γ及δ亞型的CaMKII，而心肌中最主要的類型屬δ亞型［10］。而且在δ亞型的13種剪接變異體中，只有 δB和 δC在心肌中表達［11］。雖然在本研究中我們不能確定是δ亞型哪個變異體參與了H2O2誘導的凋亡。但已有研究提示，在氧化應激時，δB和δC心肌中起著截然相反的作用:δB抑制凋亡，而δC則促進凋亡［12］。所以很可能是 δC活化介導了H2O2誘導的心肌凋亡。

總之，本研究證實左卡尼汀對H2O2誘發(fā)心肌細胞凋亡具有顯著的抑制作用，其作用機制可能與其減輕細胞內(nèi)鈣超載和抑制CaMKII活化有關。