微顆粒與急性冠脈綜合征

易鐵慈， 鄭樂民， 李建平△

(1北京大學第一醫(yī)院心內科，北京100034;2北京大學醫(yī)學部心血管所，北京100191)

冠心病是目前世界上重要的死亡原因，給社會帶來了沉重的負擔。近年來，隨著老齡化的到來，我國冠心病的發(fā)病率和死亡率迅速上升，所帶來的社會和經濟負擔亦將進一步加重。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠心病的一種較為嚴重的臨床表現(xiàn)形式，具有較高的死亡率。ACS的發(fā)生與冠脈內斑塊糜爛及破裂、血栓形成、血管痙攣等多因素導致急性或亞急性心肌供氧減少相關。一般認為，應激、炎癥等導致血管內皮細胞損傷，引起斑塊糜爛、破裂，血栓形成，引發(fā)ACS。

微顆粒(microparticle，MP)是細胞活化、凋亡過程中形成的微小顆粒。目前研究表明，MPs與人體多種病理生理過程，如自身免疫疾病、炎癥、腫瘤、血栓性疾病等均相關。近年的研究發(fā)現(xiàn)，MPs參與了斑塊的形成及破裂、凝血的啟動以及血栓的形成，是冠心病，特別是ACS過程中的重要參與者，豐富了人類對冠心病發(fā)病機制的認識。

1 微顆粒簡介

早在1946年研究者就發(fā)現(xiàn)，經過高速離心的血漿，其凝血時間比未經超離心的血漿要長，但其原因并不清楚。1967年，Wolf等發(fā)現(xiàn)了一些直徑0.1～1 μm的具有促凝活性的“血小板灰燼(platelet dust)”，稱之為 microparticles。近20余年，內皮細胞、單核細胞、淋巴細胞、紅細胞等各種細胞來源的MPs先后被發(fā)現(xiàn)，其在斑塊形成、血栓形成及炎癥、血管功能調節(jié)、信號傳遞等過程中的作用也逐步被揭示。MPs是在細胞活化、凋亡過程中形成的直徑約0.1～1μm的細小顆粒，其形成過程涉及細胞骨架的破壞、細胞膜磷脂分布的改變及顆粒形成。靜息狀態(tài)下，細胞膜在多種酶［包括內翻酶(flippase，靜息狀態(tài)激活，保持磷脂酰絲氨酸處于細胞膜內側)、外翻酶(floppase，靜息狀態(tài)失活)和亂序酶(scramblase，靜息狀態(tài)失活)等］的共同作用下保持著嚴格的極性:磷脂酰膽堿、鞘磷脂處于細胞膜外層，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)及磷脂酰乙醇胺處于細胞膜內層。同時，肌動蛋白、踝蛋白及黏著斑蛋白等構成完整的細胞骨架，協(xié)助維持細胞正常形態(tài)(圖1A)。細胞活化或進入凋亡程序后會引起Ca2+內流，細胞內鈣濃度增加，導致酶活性改變(內翻酶失活，外翻酶及亂序酶激活)，細胞膜失去內外極性。同時，凝溶膠蛋白和鈣蛋白酶等活化，引起肌動蛋白重組，細胞膜骨架破壞(圖1B)。在上述細胞膜及細胞漿內多種酶作用下，導致細胞變形、收縮，最終細胞向外形成微小囊泡，即MP［1］(圖1C)。MPs的形成是一個有序、有選擇性的過程，各細胞來源的MPs會帶有其母細胞的標志物。比如，血小板來源的MPs(PMPs)攜帶有CD42b(GP Ib)、CD41a以及 GP IIb/IIIa等;內皮細胞來源的MPs(EMPs)攜帶有CD105(內皮糖蛋白)、CD144(血管內皮鈣黏著蛋白)、CD31(血小板來源生長因子)及CD146等;單核細胞來源的MP(MMPs)可攜帶有PSGL-1(CD162，P-選擇素糖蛋白配體 1)、CD11b及 CD14等。PMPs、MMPs等還常含有組織因子(tissue factor，TF)。利用這些細胞標志物有助于識別MP的細胞來源及其母細胞狀態(tài)［2-5］。

Figure 1.The formation and structure of microparticles.A:the cell membrane at rest，which is A well-structured entity characterized by a controlled transverse distribution of lipids and proteins:flippase activated，floppase and scrambase inactivated;phosphatidylserine mainly distributes at the outside of the membrane.B:when activated，the structure of cell membrane changes:phosphatidylserine is externalized and microparticleis is released.C:the structure of microparticle，which is a disseminated storage pool of bioactive effectors，implicated in a variety of fundamental processes.MHC:major histocompatibility complex;GPI:glycosylphosphatidylinositol.The schematic diagrams were modified according to“Hugel B，Martínez MC，Kunzelmann C，et al.Membrane microparticles:two sides of the coin［J］.Physiology(Bethesda)，2005，20:22-27”.圖1 MPs的形成及結構示意圖

循環(huán)血液中及斑塊中均存在MPs，但其組成卻存在較大差異。血液中的MPs以血小板來源的為主，大約占總數(shù)(29% ±7%)。其次為紅細胞、白細胞來源的MPs。斑塊內MPs的濃度為血漿中MPs濃度的200倍以上。斑塊中MPs主要來自白細胞，包括巨噬細胞(29% ±5%)，淋巴細胞(15% ±3%)，粒細胞(8% ±1%)，而幾乎無血小板來源的MPs。相反，健康血管壁僅含極少量 MPs［6］。

2 MPs與ACS

ACS的產生與內皮細胞損傷、血小板活化聚集、血栓形成等密切相關。

2.1 MPs與內皮細胞損傷 內皮細胞在維持心血管系統(tǒng)健康狀態(tài)中有非常重要的作用。健康的內皮細胞具有抗炎、抗凝及調節(jié)血管張力的作用，而活化或進入凋亡程序的內皮細胞則具有促進局部炎癥、促進凝血的作用，導致血管舒張功能障礙，與ACS的發(fā)生密切相關。MPs既是內皮細胞活化與凋亡的標志，本身也還參與了促進內皮細胞損傷、活化的過程。

EMPs作為內皮細胞活化和凋亡的標志，再次證明了內皮細胞損傷與ACS關系。研究表明，血漿中CD31+EMP在初發(fā)心肌梗死患者中最高，再發(fā)心肌梗死及不穩(wěn)定心絞痛患者次之，在穩(wěn)定性心絞痛患者仍高于健康對照［7］。循環(huán)CD31+/CD42-EMP與STEMI時存在缺血危險的心肌的范圍相關［8］。

MPs本身也促進內皮細胞的損傷、活化。斑塊MPs能通過向內皮細胞細胞膜直接轉移細胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)，使內皮細胞細胞膜上ICAM-1水平升高，促進單核-內皮細胞黏附。有癥狀患者的斑塊MPs的這種作用更加明顯［2］。PMPs還能通過上調內皮細胞環(huán)氧化酶2的表達、促進內皮細胞釋放白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-8等炎癥介質，并直接釋放氧自由基，促進內皮細胞的活化、損傷與凋亡［9］。

調節(jié)血管張力是內皮細胞的重要功能。MPs能引起內皮細胞一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)下調，使一氧化氮(nitric oxide，NO)合成減少，導致內皮細胞凋亡，也損傷血管舒張功能［10］。CD31+/Annexin V+EMP水平與內皮細胞依賴的血管擴張功能密切相關，是血管功能失調的獨立預測因子［11］。內皮祖細胞來源的 MPs(CD34+/KDR+)亦是血管僵硬度的獨立預測因子，且獨立于Framinghan評分［12］。此外，動物研究表明，PMPs是血栓素A2的來源，參與血管張力調節(jié)［13］。

2.2 MPs與斑塊不穩(wěn)定性 易損斑塊容易發(fā)生斑塊破裂和(或)糜爛，引起高促凝活性的脂核暴露，血小板迅速聚集導致血栓形成，導致不同類型的ACS。研究表明，斑塊MPs參與了不穩(wěn)定斑塊的形成過程。除了可通過造成內皮細胞功能障礙、內皮細胞凋亡從而影響斑塊的穩(wěn)定性外，斑塊內CD40+MPs可以促進內皮細胞增生和斑塊內血管新生，增加斑塊不穩(wěn)定性［14］。此外，斑塊MPs可促進單核細胞在局部的黏附與遷移［2］，還是腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE/ADAM-17)的載體，TACE能夠剪切TNF及其受體(TNFR-1和TNFR-2)，促進人臍靜脈內皮細胞表達內皮蛋白C受體(endothelial protein C receptor，EPCR)［15］，促進局部炎癥反應。另外，由血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)或成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)刺激形成的EMPs含有大量的金屬蛋白酶亦可以破壞斑塊纖維帽［16］。因此，通過多種途徑，MPs與斑塊不穩(wěn)定有密切關系。

2.3 MPs與血栓形成 內皮功能受損、斑塊出現(xiàn)糜爛或破潰后，局部迅速出現(xiàn)血小板聚集，形成血小板血栓。同時，凝血途徑被啟動，參與血栓的形成。研究表明，MPs參與了血栓的形成與增長。

2.3.1 MPs與血小板活化 ACS發(fā)生過程中存在血小板的活化、聚集。ACS患者循環(huán)中的 PMPs(CD31+/CD42b+)在發(fā)病第1 d達峰，且與hsCRP水平相關［17］。PMPs水平對ACS患者再發(fā)栓塞事件及不良預后有預測意義［18］。同時，斑塊內MPs暴露于血液后，可與血液中的血小板相互作用，導致血小板黏附。目前認為，此過程通過多種途徑實現(xiàn):(1)血小板表達P-選擇素，與MPs表面的PSGL-1結合，使MPs與血小板黏附，聚集于血栓形成部位;(2)通過MPs表面的PS與血小板表面CD36的相互結合，也引起兩者的黏附，導致血栓不斷增長;(3)通過CD15與TF實現(xiàn)與血小板的相互作用。既往認為，血小板黏附于血栓形成部位后，通過血小板之間的相互作用使血小板聚集形成血小板性血栓。而目前的研究顯示，血小板的進一步聚集還有MPs的參與。在斑塊中與循環(huán)中的MPs的參與下，血小板被活化，并黏附、聚集，形成血栓。

2.3.2 MPs的磷脂酰絲氨酸與凝血 MPs形成過程中部分PS轉移至細胞膜外側，因此MPs是循環(huán)中活性PS重要的攜帶者。PS是一種帶負電荷的磷脂，可以結合凝血相關蛋白帶有正電荷的γ-羥基谷氨酸(γ-hydroxyglutamic acid，Gla)結構域，促進各種凝血因子的聚集，提供反應表面，促進凝血。VII因子、IX因子、X因子和凝血酶原均包含Gla域，這些蛋白在PS表面形成多種重要凝血復合物(圖2)。事實上，一旦出現(xiàn)磷脂酰膽堿轉移至細胞膜外側障礙，將導致血小板凝血酶原酶活性缺失，導致以出血為表現(xiàn)的 Scott’s綜合征。

Figure 2.Coagulation complexes assemble on a phosphatidylserine(PS)surface.Anionic phospholipids such as PS(green)bind to the cationic γ-hydroxyglutamic acid(Gla)domains within the coagulation factors(FVIIa，F(xiàn)IXa，F(xiàn)Xa，and prothrombin)，and facilitate the formation of coagulation complexes(TF:FVIIa，F(xiàn)VIIIa:FIXa，and FVa:FXa).The schematic diagram was modified according to“Owens AP 3rd，Mackman N.Microparticles in hemostasis and thrombosis［J］.Circ Res，2011，108(10):1284-1297”.圖2 磷脂酰絲氨酸表面形成凝血復合物示意圖

2.3.3 MPs的組織因子與血栓形成 TF是凝血因子VII/VIIa的受體，能激活X因子及IX因子，催化凝血反應(圖2)。既往認為凝血過程可由血管內皮下TF暴露啟動。研究表明，斑塊內來源于單核-巨噬細胞、淋巴細胞的MPs可能是血管外TF的來源之一［19］(圖3A)。斑塊脂核中的低密度脂蛋白能促進TF的表達和TF+MP的釋放，抑制巨噬細胞對MPs的清除，使含有活性 TF的 MPs在斑塊脂核中聚集［20］(圖3B)斑塊糜爛、破裂后，斑塊內的 MPs暴露于循環(huán)中，釋放出大量活性TF，啟動凝血通路，(圖3C)。

之前認為，TF僅存在于內皮下。關于MP的研究對此說法提出了質疑。研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中亦有大量 TF，主要由各種 MPs攜帶:EMPs、PMPs、MMPs及其它多種白細胞來源MPs均可攜帶TF。冠心病患者循環(huán)MPs存在強促凝活性，而阻斷TF作用后，這種促凝活性被顯著抑制［21］。靜息狀態(tài)下，機體通過多種途徑抑制TF的促凝活性以防止高凝狀態(tài):(1)一些細胞(如內皮細胞)只有在活化或凋亡時才高表達TF;(2)靜息狀態(tài)細胞膜結合的TF只存在部分促凝活性，雖可以結合VII/VIIa因子，但無法活化X因子及IX因子;(3)循環(huán)中及MPs本身攜帶的組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)通過Xa因子依賴途徑抑制TF/VIIa因子復合物的活性。這些抑制TF活性的過程被稱為“TF加密(Tissue factor encryption)”［22］。細胞活化或凋亡過程中暴露的PS可以激活TF，使其促凝活性顯著提

高。TF+MP/TFPI+MP此時也迅速上升，導致凝血活動加強。此外，TF二聚體在此時轉變?yōu)門F單體，其大分子底物結合位點暴露，從而可與IX因子、X因子結合，發(fā)揮促凝作用［23］。血栓形成過程被啟動之后，MPs上的PSGL-1與活化血小板、內皮細胞的P選擇素相互作用，使血小板和MPs相互黏附，導致TF+MPs的聚集，形成局部高濃度的TF。一旦TF達到閾濃度，就可與VII因子形成復合物，啟動凝血，促進血栓的繼續(xù)增長。這是MPs參與纖維性血栓形成的主要途徑。

2.3.4 MPs的其它參與凝血途徑物質 除了TF之外，MPs還攜帶其它多種參與血栓形成過程的物質，如選擇素、GP IIb/IIIa、花生四烯酸、血栓素A2等。EMPs表達極大 von Willebrand因子多聚體(ultralarge von Willebrand factor multimers，ULvWF)，可促進血小板聚集［24］。此外，MPs可與結合的細胞融合，向靶細胞傳遞其攜帶的分子、蛋白等。如通過PS及P選擇素與PSGL-1的共同作用，MMPs可與血小板融合，將其攜帶的PS和TF傳遞至血小板，引起血小板活化，促進凝血過程。這些物質也豐富了MPs參與ACS形成的途徑，使MPs的作用更為復雜。

2.4 治療措施對MPs的影響 近些年在治療方面的快速進展使ACS的預后得到極大地改善。介入、他汀及ACEI/ARB等治療手段所帶來的獲益得到越來越多的肯定，而其機制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，多種處理將使ACS患者的MPs水平發(fā)生變化。介入治療是ACS的重要治療手段，極大地改善了患者的預后。STEMI患者堵塞血管開通前，其內的白細胞來源的CD11a+MPs及CD105+EMPs顯著高于外周血，而血管再通后，2種MPs分別下降30%及42%，降至與外周血管一致的水平。然而，罪犯血管內的TF+MP水平在血管疏通后仍明顯高于外周循環(huán)，提示冠脈即使在再灌注治療成功后處于高凝狀態(tài)［25］。介入治療本身同時對血管是一種刺激。血管成形術后遠端保護裝置中收集的冠脈血樣本中，能監(jiān)測到高濃度的TF+MP;PCI術后8 h，循環(huán)PMP升高，且冠脈內MPs水平與“無復流”相關［17］。

Figure 3.Microparticles，tissue factor and thrombosis.A:MPs at healthy vascular.There is rarely any MPs in the vessel wall，but there are MPs in the circulation.B:MPs aggregate in the atherosclerosis plaque，some of them with TF on their surface.C:formation of thrombus:following stimulation，endothelial cells activated and interact with MPs by P-selectin.The exposure of TF+MPs in the plaque leads to the adherence of platelets and the activation of coagulation pathway.The interaction between platelets and MPs results in the aggregation of both of them，leading to the formation of platelet thrombus，and the amplification of coagulation reaction and formation of more fibrin.The schematic diagrams were modified according to“Owens AP 3rd，Mackman N.Microparticles in hemostasis and thrombosis［J］.Circ Res，2011，108(10):1284-1297”.圖3 MPs通過與血小板相互作用及攜帶TF參與血栓形成

表1 MPs的急性冠脈綜合征各個階段的作用Table 1.The contribution of MPs in ACS

他汀、ACEI/ARB均為冠心病的基礎治療，其作用機制比較復雜，尚未得到充分的理解。通過對這些治療手段對不同MPs水平影響的研究，有助于我們理解它們的作用機制。研究表明，他汀治療能降低循環(huán)中EMPs的水平，這可能是他汀內皮保護作用的表現(xiàn)。合并2型糖尿病的高血壓患者中MMPs顯著升高，但應用ARB(氯沙坦)能降低MMPs水平，以及趨化因子、黏附因子水平。在ARB基礎上加用他汀(辛伐他汀)可進一步降低炎癥因子及MMPs的水平，再一次提供了ARB及他汀類藥物抗炎作用的證據(jù)［26］?？寡“逅幬锶缏冗粮窭缀嫌冒⑺酒チ?、阿西單抗、依替巴肽均能抑制PMPs的釋放。STEMI患者在PCI基礎上應用阿西單抗處理后，以PMP為主的促凝性MP在術后第1天即顯著減少，提示炎癥反應的LMP則在發(fā)病后第6天也開始下降［27］?？寡趸瘎劬S生素C和二十碳五烯酸(一種不飽和脂肪酸)］、卡維地洛等均可降低循環(huán)MPs水平［17］。

3 總結與展望

綜上所述，MPs作為各種細胞活化、凋亡過程中的產物，在ACS過程中，既是內皮功能受損、血小板活化等過程的標志，也可能參與了ACS的發(fā)生。研究表明，MPs與動脈粥樣硬化斑塊的損傷、破潰以及凝血與血栓形成的過程均相關。然而，MPs的研究仍有很多值得進一步努力的地方。首先，MPs的研究方法目前沒有統(tǒng)一的標準。因為MPs的顆粒極小，目前應用的流式細胞儀很多對其檢測并不準確，不同型號的流式細胞儀的監(jiān)測結果亦不具可比性，使不同實驗之間難以進行橫向比較，也難以廣泛用于臨床。其次，MPs來源眾多，參與的生理病理過程極其復雜，多數(shù)研究局限于相關性研究，而其參與此過程的分子機制尚不明確，需要更多的研究探索。另外，臨床應用上，已有研究表明多種基礎治療手段均會對MPs有影響。目前有線索提示，MPs可能成為良好的治療靶點，但仍需進一步的基礎和藥理學研究作為支持。比如，由于斑塊MPs啟動初步的血小板聚集和血栓形成，而循環(huán)中MPs是促進血栓進一步增長的重要因素，如能阻斷循環(huán)中MPs參與血栓形成的過程，則可能達到既能有效防治血栓事件，又不帶來出血風險的效果?？傊?，關于MPs的研究，有望豐富對包括ACS在內的多種疾病的理解，并可能帶來治療這些疾病新的突破口。