• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    積雪草酸改善小鼠脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制研究*

    2013-12-01 02:28:56劉清霞葉開和王婧茹葉春玲張曉琦葉文才
    中國病理生理雜志 2013年7期
    關(guān)鍵詞:羅格積雪草酸

    劉清霞, 葉開和, 王婧茹, 葉春玲△, 黃 儀, 張曉琦, 葉文才

    (暨南大學(xué)藥學(xué)院1藥理學(xué)教研室,2中藥及天然藥物研究所,中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點實驗室,廣東廣州510632)

    番石榴(Psidium guajava L.)為桃金娘科番石榴屬植物,廣泛分布于我國華南地區(qū)。上世紀(jì)80年代,我國在進(jìn)行植物藥普查中發(fā)現(xiàn),民間使用番石榴葉防治糖尿病和肥胖癥有效果,以番石榴葉粗提取物為原料的制劑“消渴降糖膠囊”的臨床療效顯著,但其降血糖的活性成分和作用機(jī)制尚不清楚。本課題組首次發(fā)現(xiàn)番石榴葉總?cè)?total triterpenoids)是番石榴葉中抗糖尿病作用的主要有效部位,并能顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖水平,改善胰島素抵抗[1]。積雪草酸(asiatic acid)為五環(huán)三萜類化合物,是番石榴總?cè)频闹饕煞?,已有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化,抗炎、肝臟保護(hù)和抗糖尿病作用[2-3]。為了深入探討積雪草酸的抗糖尿病作用及其機(jī)制,本研究采用3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型,觀察積雪草酸對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化以及胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響并探討其抗糖尿病作用機(jī)制。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 細(xì)胞 3T3-L1前脂肪細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。于含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素),置于37℃、濕度95%、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng),實驗均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

    1.2 藥物與試劑 積雪草酸來源于番石榴的干燥葉,溶劑法純化工藝提取,純度為98%,實驗前用DMSO溶解,4℃保存。馬來酸羅格列酮(rosiglitazone maleate,Ros)購自上海源葉生物科技有限公司;正釩酸鈉(sodium orthovanadate,Van)購自阿拉丁公司;高糖DMEM購自Gibco;胎牛血清購自浙江天杭生物科技公司;油紅O購自Sigma;葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;游離脂肪酸測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

    1.3 儀器 NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱(NuAire);TD80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);LAC-110.4型電子天平(Acculab);Model 680酶標(biāo)儀(Bio-Rad);WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

    2 方法

    2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基,于37℃、濕度95%、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后,加含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h后,換為含10 mg/L胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h,隨后換用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每隔2 d換液,誘導(dǎo)分化8~12 d后,90%以上呈脂肪細(xì)胞表型可用于實驗。

    2.2 MTT法測定3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度為5×103cells/well。設(shè)置空白對照組(control)、溶媒對照組(medium)、積雪草酸處理組、羅格列酮(10 μmol/L)對照組和正釩酸鈉(10μmol/L)對照組??瞻讓φ战M給予正常DMEM,溶媒對照組給予含0.1%DMSO的DMEM,積雪草酸處理組分為3、10、30和100 μmol/L。3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照不同處理方法作用48 h后,每孔加入MTT(5 g/L)20μL,在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后,吸出舊培養(yǎng)液,每孔加入150μL DMSO,混勻后置酶標(biāo)儀主波長為570 nm,副波長為630 nm處測量吸光度值,觀察積雪草酸對3T3-Ll前脂肪細(xì)胞增殖的影響。增殖率(%)=(實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/空白對照組吸光度值×100%。

    2.3 油紅O染色鑒定3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度為5×103cells/well,進(jìn)行誘導(dǎo)分化實驗。在誘導(dǎo)分化第6 d加入不同濃度的藥物干預(yù),藥物分組同2.2項,作用48 h后棄去培養(yǎng)液,用PBS洗3次,用10%多聚甲醛固定30 min,棄去固定液,用滅菌水洗3次,加入油紅O溶液染色30 min后棄之,用滅菌水洗3次,顯微鏡下觀察,然后用異丙醇充分溶解染色脂肪細(xì)胞內(nèi)的油紅O,選擇520 nm波長在酶標(biāo)儀上測定吸光度值,觀察積雪草酸對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。分化率(%)=(實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/空白對照組吸光度值×100%。

    2.4 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立調(diào)整上述誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞的細(xì)胞密度,轉(zhuǎn)入96孔板中,將其分為對照組和模型組(model),對照組給予普通高糖DMEM培養(yǎng)基,模型組給予含有1μmol/L地塞米松的培養(yǎng)基,孵育96 h后取細(xì)胞上清液,用葡萄糖氧化酶法測定細(xì)胞上清液中葡萄糖的含量,用以反映胰島素抵抗的程度。葡萄糖消耗率(%)=(對照組葡萄糖含量-模型組葡萄糖含量)/對照組葡萄糖含量×100%。

    2.5 藥物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖脂代謝的影響 將分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度為5×103cells/well,建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型。確定造模成功后分為空白對照組、溶媒對照組、積雪草酸(3、10、30和100μmol/L)處理組、羅格列酮(10μmol/L)對照組和正釩酸鈉(10μmol/L)對照組??瞻讓φ战M給予正常DMEM,溶媒對照組給予含0.1%DMSO的DMEM。上述各組再分為不加胰島素處理和加胰島素處理(20 nmol/L)。藥物作用48 h后,分別用葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞上清液中葡萄糖含量、比色法檢測游離脂肪酸(free fat acid,F(xiàn)FA)的濃度。FFA抑制率(%)=(空白對照組FFA含量-實驗組FFA含量)/空白對照組FFA含量×100%。

    2.6 ELISA法測定脂聯(lián)素分泌 將建模成功的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞分為溶媒對照組(給予含0.1%DMSO的DMEM)、積雪草酸(10、30和100μmol/L)處理組、羅格列酮對照組和正釩酸鈉對照組。此外,取分化成熟的正常脂肪細(xì)胞另設(shè)為正常對照組(control),其不做任何處理。其它各組藥物作用48 h后,按試劑盒ELISA法檢測脂聯(lián)素含量。

    2.7 Western blotting法測定過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)蛋白表達(dá) 收集藥物處理后的細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,用冰PBS清洗3次,加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液,于冰上裂解10 min,將細(xì)胞刮下收集到EP管中。12 000×g、4℃離心10 min,取上清,通過Bio-Rad蛋白實驗進(jìn)行總蛋白定量。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白,然后濕轉(zhuǎn)法(200 mA、1.5 h)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后。加Ⅰ抗孵育4℃過夜,PBST清洗3次后加Ⅱ抗,37℃孵育1 h,PBST洗3次后,加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng),X線壓片曝光,采用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro32來分析膠片中的蛋白條帶。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,兩組比較采用t檢驗,多組比較采用方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 積雪草酸對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化的影響

    與溶媒對照組相比,積雪草酸在濃度10~100 μmol/L時能顯著促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖(P<0.05或P<0.01),在濃度100μmol/L時其增殖提高率達(dá)24.1%;同時,明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化(P<0.05或P<0.01)。陽性對照藥羅格列酮和正釩酸鈉的結(jié)果則表現(xiàn)為在顯著促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的同時促進(jìn)其分化(P<0.01),見表1。

    表1 積雪草酸對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響Table 1.Effects of asiatic acid on the proliferation and differentiation in 3T3-L1 preadipocytes(Mean±SD.n=6)

    2 胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立

    在地塞米松作用下,脂肪細(xì)胞對培養(yǎng)基中葡萄糖的攝取減少,導(dǎo)致模型組的葡萄糖消耗率比溶媒對照組明顯減少(減少44.2%,P<0.01),說明胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型建立成功,見圖1。

    Figure 1.The changes of glucose uptake in insulin-resistant adipocytes.Mean ± SD.n=6.** P < 0.01 vs medium group.圖1 胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取情況

    3 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和游離脂肪酸產(chǎn)生的影響

    與溶媒對照組相比,無論在基礎(chǔ)狀態(tài)還是胰島素刺激狀態(tài),積雪草酸在濃度30μmol/L和100 μmol/L時均顯著促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗(P<0.05);同時,其顯著減少胰島素抵抗細(xì)胞游離脂肪酸的產(chǎn)生,與溶媒組比較差異顯著(P<0.05)。陽性對照藥羅格列酮和正釩酸鈉的結(jié)果與積雪草酸相似,均顯著促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗,減少游離脂肪酸的產(chǎn)生(P<0.01),見表2。

    表2 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和游離脂肪酸產(chǎn)生的影響Table 2.Effects of asiatic acid on glucose uptake and FFA production in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD.n=6)

    4 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌的影響

    脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗后,其脂聯(lián)素分泌較正常對照組顯著減少(P<0.01);與溶媒對照組相比,羅格列酮能顯著增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌(P<0.01);而積雪草酸和正釩酸鈉對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌則無明顯升高作用(P>0.05),見表3。

    表3 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌的影響Table 3.Effects of asiatic acid on adiponectin secretion in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD.n=6)

    5 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PPARγ和PTP1B蛋白表達(dá)的影響

    藥物作用48 h后,與溶媒對照組相比,積雪草酸和正釩酸鈉對PPARγ蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05),但能顯著下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞PTP1B蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。羅格列酮則相反,其能顯著上調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)(P<0.01),但對PTP1B蛋白表達(dá)則無明顯影響(P >0.05),見圖2、3和表4。

    Figure 2.Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ in insulin-resistant adipocytes.1:medium group;2 ~ 4:asiatic acid(10,30 and 100 μmol/L)groups,respectively;5:Ros(10μmol/L)group;6:Van(10 μmol/L)group.圖2 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PPARγ蛋白表達(dá)的影響

    Figure 3.Effects of asiatic acid on the expression of PTP1B in insulin-resistant adipocytes.1:medium group;2 ~4:asiatic acid(10,30 and 100 μmol/L)groups,respectively;5:Van(10μmol/L)group;6:Ros(10 μmol/L)group.圖3 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PTP1B蛋白表達(dá)的影響

    表4 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PPARγ和PTP1B蛋白表達(dá)的影響Table 4.Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ and PTP1B in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD.n=6)

    討 論

    胰島素抵抗是2型糖尿病重要的發(fā)病機(jī)制之一,貫穿2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展全過程[4]。脂肪組織是胰島素作用的主要靶組織,其糖脂代謝異常在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。正常情況下白色脂肪組織以脂肪的形式儲存過量能量,一旦能量攝取持續(xù)超過能量消耗時,脂肪組織不僅體積擴(kuò)增肥大,而且脂肪細(xì)胞數(shù)量增多。肥大的脂肪細(xì)胞會分泌多種脂肪因子,如腫瘤壞死因子α、瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素等以直接干預(yù)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而過度分泌的FFA及某些脂肪因子可以進(jìn)一步影響其它組織對胰島素的敏感性,也對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性,影響其胰島素的合成和分泌,加重糖脂代謝的紊亂。

    3T3-L1前脂肪細(xì)胞系在胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的刺激下,具有分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力,是目前國際上研究胰島素抵抗、肥胖及體外脂肪細(xì)胞分化的常用工具[6]。為此,本實驗選用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型,發(fā)現(xiàn)積雪草酸顯著增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗和減少游離脂肪酸的產(chǎn)生,表明積雪草酸對胰島素抵抗具有明顯的改善作用。

    PPARγ是一種在脂肪組織發(fā)育和功能中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。激活PPARγ能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖和分化,增加對胰島素敏感的小脂肪細(xì)胞的數(shù)量,減少游離脂肪酸的產(chǎn)生,提高脂肪細(xì)胞胰島素敏感性,并最終改善胰島素抵抗。以PPARγ為靶點的噻唑烷二酮類藥物(如羅格列酮)早已作為胰島素增敏劑被廣泛應(yīng)用。脂聯(lián)素作為近年發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子之一受到廣泛關(guān)注,具有改善糖脂代謝、增加機(jī)體胰島素敏感性,改善胰島素抵抗等作用[7]。本實驗發(fā)現(xiàn),積雪草酸促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖,增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖利用,降低游離脂肪酸產(chǎn)生,該結(jié)果與羅格列酮相似。但是,對前脂肪細(xì)胞分化的影響則相反,羅格列酮表現(xiàn)為促進(jìn),而積雪草酸則表現(xiàn)為抑制作用。此外,羅格列酮能明顯增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素水平,但積雪草酸和正釩酸鈉則未有此作用。由此我們分析推測,積雪草酸改善胰島素抵抗的作用機(jī)制可能不同于羅格列酮。

    胰島素抵抗可以發(fā)生在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的多個環(huán)節(jié)。蛋白酪氨酸磷酸酶在胰島素作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用,其中PTP1B的作用尤其顯著。PTP1B主要分布于細(xì)胞漿內(nèi),胰島素與受體結(jié)合后,促使胰島素受體β亞單位和胰島素受體底物1的磷酸酪氨酸殘基去磷酸化,負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)[8-9]。越來越多的證據(jù)表明:PTP1B通過去磷酸化作用影響了胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),對胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生起重要作用[10-11]。PTP1B抑制劑可抑制胰島素受體的去磷酸化,從而延長和擴(kuò)大胰島素關(guān)鍵性早期信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此,尋找高效特異性的PTP1B抑制劑為治療2型糖尿病和肥胖開辟了新的途徑。正釩酸鈉是公認(rèn)的PTP1B抑制劑,故本實驗選擇它作為陽性對照藥之一,結(jié)果發(fā)現(xiàn)積雪草酸與正釩酸鈉作用相似,在提高胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的葡萄糖利用、減少游離脂肪酸產(chǎn)生的同時,對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌以及PPARγ蛋白表達(dá)無明顯影響,但可下調(diào)PTP1B蛋白表達(dá)。因此,我們推測,下調(diào)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子PTP1B,促進(jìn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),可能是積雪草酸改善胰島素抵抗的主要機(jī)制。

    猜你喜歡
    羅格積雪草酸
    曾擔(dān)任過12年國際奧委會主席的雅克·羅格逝世,享年79歲
    英語文摘(2021年11期)2021-12-31 03:25:24
    你看到的是美,我看到的是責(zé)任
    我們
    大糧積雪 誰解老將廉頗心
    炎黃地理(2017年10期)2018-01-31 02:15:05
    積雪
    草酸鈷制備中的形貌繼承性初探
    2000~2014年西藏高原積雪覆蓋時空變化
    對不起
    金山(2016年9期)2016-10-12 14:22:23
    午夜免费观看性视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品偷伦视频观看了| 一区二区三区四区激情视频| 99久久精品热视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人二区视频| 99国产精品免费福利视频| 男人舔奶头视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩国内少妇激情av| 边亲边吃奶的免费视频| 有码 亚洲区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av黄色大香蕉| 欧美三级亚洲精品| 国产男人的电影天堂91| 国产片特级美女逼逼视频| 国产 一区 欧美 日韩| 伦理电影大哥的女人| 欧美日韩在线观看h| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成年人午夜在线观看视频| 国产 一区 欧美 日韩| 久久国产精品大桥未久av | 久久精品国产自在天天线| 搡老乐熟女国产| 精品人妻熟女av久视频| 丝袜喷水一区| 在线播放无遮挡| 人体艺术视频欧美日本| 国产高潮美女av| 99热国产这里只有精品6| 精品久久久久久久久亚洲| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 青青草视频在线视频观看| 国模一区二区三区四区视频| 午夜激情福利司机影院| 久久精品国产亚洲av天美| 九草在线视频观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美zozozo另类| 国产精品蜜桃在线观看| 国产在线免费精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人无遮挡网站| 国产深夜福利视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 中国三级夫妇交换| 激情 狠狠 欧美| 最近的中文字幕免费完整| 99热这里只有是精品50| 男的添女的下面高潮视频| 精品久久国产蜜桃| 韩国高清视频一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产一级毛片在线| 五月开心婷婷网| 久久国产乱子免费精品| 激情五月婷婷亚洲| 99热全是精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品,欧美精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲欧美精品自产自拍| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美成人a在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 一级毛片aaaaaa免费看小| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女内射精品一级片tv| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 深夜a级毛片| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲人与动物交配视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av国产av综合av卡| 免费观看性生交大片5| 国产精品久久久久久久久免| 久久国产精品大桥未久av | 春色校园在线视频观看| 99久久精品一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品久久国产蜜桃| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲中文av在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 美女cb高潮喷水在线观看| 一级爰片在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 在线观看国产h片| 韩国av在线不卡| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 97热精品久久久久久| videos熟女内射| 亚洲电影在线观看av| 91aial.com中文字幕在线观看| 七月丁香在线播放| 秋霞在线观看毛片| 波野结衣二区三区在线| 亚洲自偷自拍三级| 成人二区视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 色视频在线一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 丝袜脚勾引网站| 蜜臀久久99精品久久宅男| 各种免费的搞黄视频| 日韩欧美精品免费久久| 午夜精品国产一区二区电影| 尾随美女入室| 在线天堂最新版资源| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲伊人久久精品综合| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产成人一精品久久久| 另类亚洲欧美激情| 日本免费在线观看一区| 最新中文字幕久久久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 插阴视频在线观看视频| 国产精品伦人一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 日本午夜av视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 七月丁香在线播放| 中国国产av一级| 国产精品嫩草影院av在线观看| 内地一区二区视频在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 全区人妻精品视频| 99热国产这里只有精品6| 国产视频首页在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产成人一区二区在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜激情福利司机影院| 一个人看的www免费观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产视频内射| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品久久国产蜜桃| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 97热精品久久久久久| 成年女人在线观看亚洲视频| 一区二区av电影网| 日韩一区二区三区影片| 亚洲第一区二区三区不卡| 多毛熟女@视频| 欧美 日韩 精品 国产| 大香蕉久久网| 久久ye,这里只有精品| 91精品国产九色| 亚洲成人av在线免费| 一级片'在线观看视频| a级毛色黄片| 免费av不卡在线播放| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产视频内射| 永久网站在线| 国产高清有码在线观看视频| h视频一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 欧美成人a在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产美女午夜福利| 老司机影院毛片| 成人特级av手机在线观看| 香蕉精品网在线| 国产熟女欧美一区二区| 久久6这里有精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲国产精品专区欧美| 五月天丁香电影| 伊人久久精品亚洲午夜| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲av综合色区一区| 亚洲经典国产精华液单| 精品久久久久久久久av| 久久久久久久久久久丰满| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 18禁在线播放成人免费| 国产乱人偷精品视频| 国产乱人视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 蜜桃在线观看..| 一区二区av电影网| 免费看av在线观看网站| 我的老师免费观看完整版| 免费大片18禁| 日韩欧美一区视频在线观看 | 91精品伊人久久大香线蕉| 99热这里只有是精品50| 草草在线视频免费看| 国产人妻一区二区三区在| 不卡视频在线观看欧美| 精品久久久久久久久av| 日日啪夜夜爽| 黄片wwwwww| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美区成人在线视频| 久久ye,这里只有精品| 新久久久久国产一级毛片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 丰满少妇做爰视频| 免费大片黄手机在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 在线精品无人区一区二区三 | 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 性色av一级| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 搡老乐熟女国产| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产亚洲5aaaaa淫片| 丰满少妇做爰视频| 五月开心婷婷网| 伦理电影免费视频| 日本欧美视频一区| 日韩伦理黄色片| 简卡轻食公司| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久伊人网av| 亚洲成人一二三区av| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 日韩av免费高清视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99久久精品一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 一个人看的www免费观看视频| 中国国产av一级| 亚洲第一av免费看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日日啪夜夜爽| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧洲日产国产| 最近的中文字幕免费完整| 高清视频免费观看一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 美女福利国产在线 | 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久人人爽人人爽人人片va| 简卡轻食公司| 亚洲,欧美,日韩| 免费播放大片免费观看视频在线观看| videossex国产| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产视频内射| 国产成人精品福利久久| 久久久成人免费电影| 99久久精品国产国产毛片| 男女无遮挡免费网站观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 午夜福利视频精品| 日本欧美视频一区| 久久久久久人妻| 久久这里有精品视频免费| 岛国毛片在线播放| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 久久国产精品大桥未久av | 少妇被粗大猛烈的视频| 毛片女人毛片| 国产成人精品一,二区| freevideosex欧美| 日韩欧美精品免费久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品一二三区在线看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费观看a级毛片全部| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲av日韩在线播放| 色哟哟·www| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产91av在线免费观看| av在线蜜桃| 国产亚洲最大av| 色视频www国产| 国产精品一区二区在线观看99| 大陆偷拍与自拍| 精品一区在线观看国产| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品成人在线| 一区二区三区乱码不卡18| 黄色欧美视频在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品免费大片| 国产精品一二三区在线看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 在线观看美女被高潮喷水网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www | 18禁在线播放成人免费| 欧美精品亚洲一区二区| 人妻一区二区av| 99久久精品热视频| 中文字幕制服av| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品一区www在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 老司机影院成人| 九九在线视频观看精品| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品一区二区在线观看99| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产伦理片在线播放av一区| 视频中文字幕在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 一级黄片播放器| 永久免费av网站大全| 国产在视频线精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 一区二区三区乱码不卡18| av天堂中文字幕网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av福利片在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产高清不卡午夜福利| 成人无遮挡网站| 老司机影院毛片| 美女内射精品一级片tv| 高清午夜精品一区二区三区| 一本一本综合久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 九草在线视频观看| 久久6这里有精品| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| av专区在线播放| av国产免费在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国产av一区二区精品久久 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 成人特级av手机在线观看| 欧美成人午夜免费资源| freevideosex欧美| 丰满少妇做爰视频| 亚洲国产精品999| av免费在线看不卡| 色视频www国产| 大话2 男鬼变身卡| 欧美zozozo另类| 国产午夜精品一二区理论片| 高清日韩中文字幕在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 制服丝袜香蕉在线| 久久6这里有精品| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 97精品久久久久久久久久精品| 在线观看av片永久免费下载| a级毛色黄片| 欧美精品一区二区免费开放| 极品教师在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 91精品伊人久久大香线蕉| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 好男人视频免费观看在线| 九九在线视频观看精品| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲欧美一区二区三区国产| 中文欧美无线码| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久人人爽人人爽人人片va| 国产又色又爽无遮挡免| 久久影院123| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品.久久久| av卡一久久| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品人妻视频免费看| 久久久久久久国产电影| 一本色道久久久久久精品综合| 男人添女人高潮全过程视频| 男女国产视频网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美成人a在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 22中文网久久字幕| 日韩一区二区三区影片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 又爽又黄a免费视频| 亚洲自偷自拍三级| 18+在线观看网站| 18禁在线播放成人免费| 国产黄片美女视频| 久久久色成人| 只有这里有精品99| 九九爱精品视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 交换朋友夫妻互换小说| 99热这里只有是精品在线观看| 日本午夜av视频| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av福利一区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产精品久久久久久久久免| 国产成人免费观看mmmm| 人妻 亚洲 视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲不卡免费看| 国产精品一及| av视频免费观看在线观看| 综合色丁香网| 人体艺术视频欧美日本| 最近2019中文字幕mv第一页| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久久久久久丰满| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 三级国产精品片| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 18+在线观看网站| 一区二区三区四区激情视频| 欧美三级亚洲精品| 三级国产精品片| 又大又黄又爽视频免费| 日韩视频在线欧美| 成人漫画全彩无遮挡| 青春草亚洲视频在线观看| 国产毛片在线视频| 亚洲国产最新在线播放| 欧美精品一区二区大全| 妹子高潮喷水视频| 久久久成人免费电影| 免费人成在线观看视频色| 久久综合国产亚洲精品| 欧美区成人在线视频| 国产精品一区www在线观看| 日本av免费视频播放| 高清毛片免费看| 黑人高潮一二区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 美女福利国产在线 | 亚洲国产最新在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 晚上一个人看的免费电影| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品一二三| 国产精品久久久久久av不卡| 91久久精品电影网| 成人二区视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩一区二区视频免费看| 五月伊人婷婷丁香| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产av精品麻豆| 国产亚洲最大av| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲第一av免费看| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久久性生活片| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 色吧在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久精品久久精品一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 如何舔出高潮| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久久久久成人| 亚洲四区av| 国产一区二区三区av在线| 一个人免费看片子| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 大话2 男鬼变身卡| 晚上一个人看的免费电影| 在线观看三级黄色| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 男人和女人高潮做爰伦理| 日本与韩国留学比较| 97在线人人人人妻| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 久久人人爽人人片av| 日韩精品有码人妻一区| 国产伦精品一区二区三区四那| 免费观看性生交大片5| 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久久久久久久久久免费av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 在线观看一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产爱豆传媒在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲精品乱久久久久久| 内射极品少妇av片p| 亚洲av免费高清在线观看| 中文欧美无线码| 成人美女网站在线观看视频| 成人特级av手机在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩成人伦理影院| 日本欧美国产在线视频| 最黄视频免费看| 日韩欧美一区视频在线观看 | av在线app专区| 一级二级三级毛片免费看| 免费观看在线日韩| 国产精品久久久久久精品古装| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产片特级美女逼逼视频| 在线观看一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲综合精品二区| 亚洲欧美精品专区久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久久久久久久久丰满| 成人漫画全彩无遮挡| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 精品熟女少妇av免费看| 美女高潮的动态| 一级片'在线观看视频| 亚洲色图av天堂| 97精品久久久久久久久久精品| 一级毛片 在线播放| 亚洲无线观看免费| 国产亚洲精品久久久com| 久久精品国产自在天天线| 丝袜喷水一区| 久久久久久久精品精品| 永久免费av网站大全| 国产91av在线免费观看| 我要看日韩黄色一级片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 免费看日本二区| 97在线视频观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久人妻精品一区果冻| 天堂中文最新版在线下载| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费av不卡在线播放| 三级国产精品片| 午夜激情久久久久久久| .国产精品久久| 国产精品久久久久久精品古装| 精品久久国产蜜桃| 熟女电影av网| 91精品国产九色| 伦理电影免费视频| 国产av码专区亚洲av| 成人二区视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产av精品麻豆| 亚洲精品第二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 |