微流控芯片免疫分析方法的研究進(jìn)展

樊斐，張國(guó)軍，康熙雄

微流控芯片技術(shù)是利用微通道精確控制和處理微尺度流體，從而在微芯片上實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣、稀釋、混合、反應(yīng)、檢測(cè)等多種功能，其最突出的優(yōu)點(diǎn)是只需少量標(biāo)本或生物樣品，便可高效快速地完成各種微分析檢測(cè)，并具有高靈敏度、高通量、低成本和設(shè)備微型化的優(yōu)勢(shì)[1]。近年來(lái)微流控芯片技術(shù)發(fā)展迅速，在分析領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。鑒于微流控芯片具有在微小尺度下同時(shí)完成大樣本量并行操作等優(yōu)勢(shì)，將微流控芯片技術(shù)與免疫分析結(jié)合，是近些年新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，大大改善了傳統(tǒng)免疫分析性能。本文將從微流控免疫分析的芯片制作、類型和多元免疫分析等多個(gè)方面介紹微流控芯片免疫分析方法的研究進(jìn)展。

1 微流控芯片的制作

1.1 載體材料

微流控芯片載體的材料有很多，其中最常見(jiàn)的是硅、玻璃和聚合物材料。不同材料具有不同的特性，如硬度、導(dǎo)電性、疏水性、透光性等方面的差異，而要在微流控的平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)不同功能就需要利用這些不同的特性。

1.1.1 硅材料 硅材料耐高溫并具有良好的導(dǎo)熱性，結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，可通過(guò)成熟的微加工方法進(jìn)行形貌加工，故曾作為早期微流控芯片制作的主要材料。但由于其光學(xué)不透明和本身導(dǎo)電的特點(diǎn)，無(wú)法進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)以及電滲流液體運(yùn)輸[2]，而且制作成本昂貴、耗時(shí)，這些不足限制了硅在微流控免疫分析中的實(shí)際應(yīng)用。因此，硅更多應(yīng)用于光刻中模板的制備。

1.1.2 玻璃材料 與硅相比，玻璃相對(duì)便宜，透光且不導(dǎo)電，很快便取代了硅的位置。然而玻璃易碎，加工手段有限，而且玻璃在濕法蝕刻過(guò)程中很難做出高深寬比的結(jié)構(gòu)，雖然后續(xù)發(fā)展的干法蝕刻可得到較高深寬比的結(jié)構(gòu)，但價(jià)格昂貴。

1.1.3 聚合物材料 近些年，高分子聚合物材料由于低成本、制作過(guò)程簡(jiǎn)單，被視為制作微芯片的理想材料。許多微流控應(yīng)用是在聚合物基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)的，包括聚碳酸酯（polycarbonate，PC），聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmecrylate，PMMA）和聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）等。其中 PDMS是目前使用最為廣泛的一種高聚物材料，具有化學(xué)惰性、光學(xué)透明、電絕緣性、生物兼容性好、可塑性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于表面疏水性的特點(diǎn)使得這一材料應(yīng)用于免疫分析時(shí)受到限制，例如液體中易形成氣泡、耐久性差、蛋白和小分子非特異性吸附等問(wèn)題。不過(guò)，這些問(wèn)題可通過(guò)表面修飾來(lái)解決。

1.2 加工方法

高聚物材料是微流控研究中常用的材料，以其為基片加工微流控芯片的方法主要有模塑法、熱壓法、激光刻蝕法和軟光刻等，其中最常用的是模塑法和熱壓法。

1.2.1 模塑法 首先利用光刻和蝕刻的方法制作通道部分突起的陽(yáng)模，然后在陽(yáng)模上澆注液體的高分子材料，將固化后的高分子材料與陽(yáng)模剝離后就得到了具有微結(jié)構(gòu)的通道。這一方法簡(jiǎn)單易行，不需要高技術(shù)設(shè)備，可用于大量生產(chǎn)芯片。

1.2.2 熱壓法 具體步驟為在熱壓裝置中將高聚物基片與陽(yáng)模緊貼在一起，當(dāng)基片加熱到軟化溫度后，對(duì)陽(yáng)模施加壓力，可在基片上印制出相應(yīng)的微結(jié)構(gòu)。將陽(yáng)模和基片一起冷卻后脫模，就得到所需的微結(jié)構(gòu)。此法比較適用于PMMA和PC等聚合物材料。熱壓法可實(shí)現(xiàn)批量復(fù)制，設(shè)備及操作相對(duì)簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)較高程度的自動(dòng)化生產(chǎn)[3]。

2 微流控芯片上的免疫分析

免疫分析是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的一種分析方法，具有極高靈敏度和特異性，但常規(guī)免疫分析通常需要數(shù)小時(shí)，操作過(guò)程煩瑣，消耗大量試劑和樣本，并且檢測(cè)設(shè)備較大，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的要求。與傳統(tǒng)微孔板免疫分析相比，微流控芯片免疫分析具有以下優(yōu)勢(shì)：①操作簡(jiǎn)便，儀器微型化；②免疫反應(yīng)在微通道中進(jìn)行，比表面積大，擴(kuò)散距離顯著縮短，加快了抗原抗體反應(yīng)，縮短了反應(yīng)時(shí)間；③體積小，節(jié)約試劑和樣本；④可多樣本、多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)[4-5]。對(duì)常規(guī)免疫分析和微流控免疫分析進(jìn)行比較（表1），不難看出微流控芯片免疫分析有很多優(yōu)點(diǎn)，但目前仍處于基礎(chǔ)研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)階段。根據(jù)免疫試劑是否均相存在，可將微流控芯片免疫分析分為異相免疫分析和均相免疫分析。

表1 微流控芯片免疫分析與常規(guī)免疫分析的比較

2.1 異相微流控免疫分析

異相微流控免疫分析常采用夾心法，利用固定在固相載體表面上的抗體或抗原捕獲待測(cè)抗原或抗體，其優(yōu)點(diǎn)是能使抗原或抗體從稀溶液中富集至固相載體表面，但是需要在檢測(cè)前將游離的和結(jié)合的標(biāo)志物分離。

2.1.1 蛋白質(zhì)固定 固定蛋白質(zhì)的方法有很多種，包括直接吸附、共價(jià)化學(xué)連接和生物親和反應(yīng)?？贵w等生物分子可以通過(guò)疏水作用直接吸附在疏水性微通道的表面，但是可能引起抗體的構(gòu)象改變而導(dǎo)致活性降低。Yakovleva等[6]采用了五種不同的方法在硅片的表面固定抗體，指出抗體直接吸附在硅片表面時(shí)由于在吸附過(guò)程中構(gòu)象的改變導(dǎo)致抗體部分或者完全變性，因此需要控制抗體結(jié)合的種類和方位?；瘜W(xué)連接是通過(guò)將活化的蛋白位點(diǎn)與免疫反應(yīng)基底上的特殊官能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，將蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵連接到反應(yīng)基底上。此方法比物理吸附有更好的空間取向性，也可以保存更長(zhǎng)時(shí)間。Wang等[7]利用共聚物處理 PMMA 微通道的內(nèi)表面以具有硅醇基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)抗體在PMMA 微管道表面的固定。此方法不僅保護(hù)了抗體的生物活性并可抵抗非特異性吸附。生物親和反應(yīng)指在表面接上生物親和分子，再通過(guò)生物親和分子與蛋白質(zhì)反應(yīng)，將蛋白質(zhì)以一定取向固定到基底表面。此種方法可以提高抗原的捕獲效率，最大限度地降低空間位阻，將反應(yīng)位點(diǎn)暴露出來(lái)。Wen等[8]用生物素-聚L-賴氨酸接枝聚乙二醇（biotin- PLL-g-PEG）作為表面連接劑降低抗體和通道表面的排斥力，并通過(guò)親和素橋?qū)⒐潭ㄔ诳贵wFc 段的生物素化的蛋白 A 連接到生物素化的PMMA 表面，促進(jìn)了抗體的連接和捕獲。蛋白質(zhì)的固定直接影響到分析的靈敏度和重復(fù)性，因此對(duì)于微流控芯片免疫分析系統(tǒng)，采用合理的方法交聯(lián)抗體顯得非常重要。

2.1.2 微流控芯片封閉 由于微流控芯片的高比表面積，蛋白和通道的作用加強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白非特異性吸附增強(qiáng)，這些非特異結(jié)合不僅會(huì)影響分析效率，而且使背景增高。因此，可在完成目標(biāo)蛋白的固定后將其他無(wú)蛋白質(zhì)的區(qū)域進(jìn)行封閉，以防止待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)與之結(jié)合，形成非特異性反應(yīng)。封閉劑一般選用小分子化合物，最常用的有脫脂奶粉和牛血清白蛋白。

2.1.3 洗滌 通過(guò)洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，以清除殘留在微通道內(nèi)沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。如 PDMS 膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸附強(qiáng)，洗滌可把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。洗滌雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。

2.1.4 常用檢測(cè)方法 以微流控芯片為平臺(tái)的各種化學(xué)反應(yīng)對(duì)檢測(cè)方法的要求比傳統(tǒng)免疫檢驗(yàn)更嚴(yán)格。光學(xué)檢測(cè)由于簡(jiǎn)單、干擾小是目前微流控芯片研究中應(yīng)用最廣泛的方法，其中最常用的是熒光檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法[9]。Lin等[10]在PDMS 芯片上用夾心免疫熒光法檢測(cè)了人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，檢出限為4 pmol/L?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)靈敏度高，無(wú)需外來(lái)光源，降低了對(duì)設(shè)備的要求，易于微型化和集成化，是一種非常好的定量分析方法，符合微流控芯片的發(fā)展趨勢(shì)。Kamruzzaman等[11]將微流控芯片與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相結(jié)合完成對(duì) L-苯丙氨酸的測(cè)定。除此之外，還有電化學(xué)檢測(cè)法等。

2.1.5 應(yīng)用 Kido等[12]在微芯片上實(shí)現(xiàn) ELISA 方法檢測(cè)牙槽縫隙液體中的鈣網(wǎng)蛋白。通過(guò)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)，與傳統(tǒng) ELISA 方法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示線性相關(guān)，r2=0.981。Haes等[13]利用具有雙堰結(jié)構(gòu)的微流控芯片通道來(lái)固定包被有葡萄球菌 B 型腸毒素（SEB）抗體的聚苯乙烯微珠，先與熒光標(biāo)記的抗原充分反應(yīng)后，再加入未標(biāo)記的SEB 抗原。由于未標(biāo)記的抗原與抗體的親和力遠(yuǎn)大于標(biāo)記抗原與抗體的親和力，此時(shí)標(biāo)記抗原被置換出來(lái)，檢測(cè)芯片上置換出來(lái)的標(biāo)記抗原的熒光信號(hào)，此信號(hào)強(qiáng)度與抗原濃度成正比，分析時(shí)間僅需 20 min，檢測(cè)限為1 fmol/L（28.5 fg/ml）。Huang等[14]用超順磁珠作為甲胎蛋白（AFP）抗體的固相載體，采用雙抗體夾心的方法，在微流控芯片的平臺(tái)上檢測(cè) AFP，分析時(shí)間僅需 20 min，檢測(cè)范圍為1～800 ng/ml，檢測(cè)限達(dá) 0.23 ng/ml。

2.2 均相微流控免疫分析

均相免疫分析的免疫試劑和待測(cè)物在同一相中，可通過(guò)微流控芯片上不同的微通道流入免疫反應(yīng)微池或反應(yīng)通道，進(jìn)行特異性反應(yīng)。因此免去了抗體固定和洗滌步驟，也無(wú)需考慮固相載體上的非特異性吸附。但因?yàn)槊庖叻磻?yīng)形成了復(fù)合物，一般需要對(duì)混合物進(jìn)行分離之后才能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。通?？筛鶕?jù)擴(kuò)散特點(diǎn)、等電點(diǎn)、熒光偏振、熒光共振能量轉(zhuǎn)移及酶活性的不同而區(qū)別，但最常用的是毛細(xì)管電泳分離，即利用免疫復(fù)合物與游離的抗原、抗體的電荷不同而分離[15]。然而，電泳分離效率受樣品基體影響較大，有時(shí)不能有效分離。此外，只有當(dāng)復(fù)合物與游離抗原、抗體電泳遷移速率明顯不同時(shí)，才能使用電泳分離；如果分析物是蛋白質(zhì)或大分子，抗原抗體復(fù)合物可能沉淀或形成多種復(fù)合物，也會(huì)影響分離效果。

Herr等[16]研究一種基于凝膠電泳的免疫分析微流控芯片。將樣本前處理（混合、孵育和富集）和電泳免疫分析整合在一起，在10 min 內(nèi)完成 20 μl的唾液中的基質(zhì)金屬蛋白酶 8（MMP-8）的檢測(cè)。Wang等[17]采用微流控芯片電泳的方法檢測(cè)牛奶和肌肉中殘留的磺胺類藥物，4 種磺胺類藥物在1 min 內(nèi)分離，檢測(cè)限為0.2～2.3 μg/L，具有良好的重復(fù)性。Karns和Herr[18]還嘗試使用電泳的方法分析人眼淚中的蛋白含量，來(lái)進(jìn)行眼睛相關(guān)的疾病和病理學(xué)分析，發(fā)展了一種非侵入的基于眼淚的診斷技術(shù)。乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是一種存在于眼淚中對(duì)干燥綜合征有特異性的生物標(biāo)志物，利用均相電泳免疫檢測(cè)方法，可以在5 s 內(nèi)檢測(cè)乳鐵蛋白的含量，僅需要檢測(cè) 1 μl的眼淚。結(jié)果表明，芯片檢測(cè)相對(duì)于ELISA 有更低的檢測(cè)限。

3 多元免疫分析

多元免疫分析指對(duì)單個(gè)樣本的多種分析物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，不僅減少了昂貴分析樣品的用量，而且極大地降低了分析成本。這種分析模式已是微型全分析系統(tǒng)（micro total analysis system，μTAS）新的發(fā)展方向，而且在某些領(lǐng)域尤其受到重視，如醫(yī)學(xué)診斷、蛋白質(zhì)組學(xué)等。作為多元免疫分析的平臺(tái)，最常用的是表面微陣列和微珠[19]。但在多元免疫分析中幾種標(biāo)記物的測(cè)定條件需要相互協(xié)調(diào)，限制了測(cè)定的靈敏度。

3.1 基于表面微陣列的多元免疫分析

微陣列是將不同或相同的抗體固定在芯片通道中不同位置而形成的，一次進(jìn)樣能同時(shí)檢測(cè)多種分析物，或同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。Delamarche等[20]曾經(jīng)報(bào)道了一個(gè)尤為著名的方法，稱為微流網(wǎng)絡(luò)（μFNs）。先用一個(gè) μFN 傳輸?shù)鞍资蛊湟詶l帶的形式固定在基底的表面，并在其垂直方向上用第二個(gè) μFN 傳送分析所需要的溶液，因此，芯片上形成了馬賽克型的結(jié)構(gòu)，在發(fā)生反應(yīng)的地方才會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。大多數(shù)的多元免疫分析都是基于這種模式實(shí)現(xiàn)。如 Yang等[21]利用微芯片平行連續(xù)稀釋檢測(cè)人血漿中的人免疫缺陷病毒（HIV）抗體，實(shí)驗(yàn)將一片已包被 HIV 抗原的PC 膜固定在兩片 PDMS 中間，其中一片 PDMS 刻有微通道，并在相應(yīng)的液流匯合的管道內(nèi)做了混合裝置，使充分混合，另一片 PDMS 為基片，通過(guò)對(duì)流體的控制，可檢測(cè)到不同稀釋濃度的樣本。該法可同時(shí)檢測(cè)不同濃度的多種抗原或抗體，提高分析效率。

3.2 基于微珠的多元免疫分析

基于微珠多元分析的原理是通過(guò)給微珠編碼，然后對(duì)微珠上的信號(hào)解碼而實(shí)現(xiàn)。最簡(jiǎn)單的方法是將包被有抗體的微珠分隔到不同的隔間內(nèi)，讓樣本充分與這些微珠接觸反應(yīng)。但芯片本身體積很小，所以可安裝的隔間數(shù)量有限，而且樣本量也須充足才能與所有隔間的微珠接觸。用來(lái)解碼微珠的方法包括光學(xué)、電學(xué)及物理方法等，而在微流控平臺(tái)進(jìn)行多元免疫分析最常用的方法是熒光編碼。Riegger等[22]用標(biāo)有熒光基團(tuán)的微珠檢測(cè)了兩種分析物，但受到染料數(shù)量的限制。另一種解碼方法是運(yùn)用二維編碼技術(shù)，如 Lminex 系統(tǒng)的xMAP，將微珠用兩種顏色的染料標(biāo)記，在10 種不同強(qiáng)度下結(jié)合，可產(chǎn)生 100 種識(shí)別碼。

4 展望

經(jīng)過(guò)近 10年的快速發(fā)展，微流控芯片免疫分析方法已經(jīng)取得了喜人的成績(jī)，該方法快速、高效、低耗、有較高的特異性和靈敏度，應(yīng)用前景廣闊，但仍存在一些不足，如對(duì)一些復(fù)雜的未進(jìn)行預(yù)處理的樣本很難進(jìn)行分析，微通道內(nèi)壁修飾、抗體的固定及檢測(cè)的自動(dòng)控制等技術(shù)還有待改進(jìn)和完善，分析結(jié)果的可靠性及芯片的穩(wěn)定性還需要提高，以及配套儀器的微型化等。微流控免疫分析技術(shù)是多學(xué)科的融合與運(yùn)用，包括生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、微電子、材料、微機(jī)械等，伴隨著各個(gè)學(xué)科技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)有望成為生命科學(xué)最主要的分析研究手段之一。

[1]Pan AP, Jin QH, Wang HM, et al.Microfluidic chip immunoassay and its research progress.Lab Med, 2007, 22(4):508-510.(in Chinese)潘愛(ài)平, 金慶輝, 王惠民,等.微流控芯片免疫分析技術(shù)及其研究進(jìn)展.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2007, 22(4):508-510.

[2]Hervás M, López MA, Escarpa A.Electrochemical immunosensing on board microfluidic chip platforms.TrAC Trends Anal Chem, 2012(31):109-128.

[3]Zheng XL, Yan JW, Hu N, et al.Research progress of materials and fabrication methods of microfluidic chip.Transducer Microsystem Technologies, 2011, 30(6):1-4, 7.(in Chinese)鄭小林, 鄢佳文, 胡寧,等.微流控芯片的材料與加工方法研究進(jìn)展.傳感器與微系統(tǒng), 2011, 30(6):1-4, 7.

[4]Leng C, Zhang XQ, Ju HX.Microfluidic chip-based immunoassay.Prog Chem, 2009, 21(4):687-695.(in Chinese)冷川, 張曉清, 鞠熀先.微流控芯片上的免疫分析.化學(xué)進(jìn)展,2009, 21(4):687-695.

[5]Lin CC, Wang JH, Wu HW, et al.Microfluidic immunoassays.J Assoc Lab Automation, 2010, 15(3):253-274.

[6]Yakovleva J, Davidsson R, Bengtsson M, et al.Microfluidic enzyme immunosensors with immobilised protein A and G using chemiluminescence detection.Biosens Bioelectron, 2003, 19(1):21-34.

[7]Wang H, Meng S, Guo K, et al.Microfluidic immunosensor based on stable antibody-patterned surface in PMMA microchip.Electrochem Commun, 2008, 10(3):447-450.

[8]Wen X, He H, Lee LJ.Specific antibody immobilization with biotin-poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) and protein A on microfluidic chips.J Immunol Methods, 2009, 350(1-2):97-105.

[9]Chen ZN, Liu BH, Wu HL, et al.Developments in microfluidics-based immunoassays.Chem J Chin Univ, 2011, 32(5):1001-1007.(in Chinese)陳肇娜, 劉寶紅, 吳會(huì)靈,等.微流控免疫芯片檢測(cè)方法的研究進(jìn)展.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2011, 32(5):1001-1007.

[10]Lin DH, Taylor CR, French Anderson W, et al.Internally calibrated quantification of VEGF in human plasma by fluorescence immunoassays in disposable elastomeric microfluidic devices.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2010, 878(2):258-263.

[11]Kamruzzaman M, Alam AM, Kim KM, et al.Microfluidic chip based chemiluminescence detection of L-phenylalanine in pharmaceutical and soft drinks.Food Chem, 2012, 135(1):57-62.

[12]Kido J, Abe K, Yatsushiro S, et al.Determination of calprotectin in gingival crevicular fluid by immunoassay on a microchip.Clin Biochem, 2012, 45(15):1239-1244.

[13]Haes AJ, Terray A, Collins GE.Bead-Assisted displacement immunoassay for staphylococcal enterotoxin B on a microchip.Anal Chem, 2006, 78(24):8412-8420.

[14]Huang H, Zheng XL, Zheng JS, et al.Rapid analysis of alpha-fetoprotein by chemiluminescence microfluidic immunoassay system based on super-paramagnetic microbeads.Biomed Microdevices, 2009, 11(1):213-216.

[15]Wang MM, Zhang HY, Li QL, et al.Review on the development of microfluidic-chip immune-electrophoresis analysis.Chem Res Application, 2013, 25(1):1-6.(in Chinese)王孟孟, 張鴻雁, 李清嶺,等.微流控芯片免疫電泳分析方法研究進(jìn)展.化學(xué)研究與應(yīng)用, 2013, 25(1):1-6.

[16]Herr AE, Hatch AV, Throckmorton DJ, et al.Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(13):5268-5273.

[17]Wang L, Wu J, Wang Q, et al.Rapid and sensitive determination of sulfonamide residues in milk and chicken muscle by microfluidic chip electrophoresis.J Agric Food Chem, 2012, 60(7):1613-1618.

[18]Karns K, Herr AE.Human tear protein analysis enabled by an alkaline microfluidic homogeneous immunoassay.Anal Chem, 2011, 83(21):8115-8122.

[19]Ng AH, Uddayasankar U, Wheeler AR.Immunoassays in microfluidic systems.Anal Bioanal Chem, 2010, 397(3):991-1007.

[20]Delamarche E, Bernard A, Schmid H, et al.Patterned delivery of immunoglobulins to surfaces using microfluidic networks.Science,1997, 276(5313):779-781.

[21]Yang D, Niu X, Liu Y, et al.Electrospun nanofibrous membranes: a novel solid substrate for microfluidic immunoassays for HIV.Adv Mater, 2008, 20(24):4770-4775.

[22]Riegger L, Grumanna M, Nann T, et al.Read-out concepts for multiplexed bead-based fluorescence immunoassays on centrifugal microfluidic platforms.Sensors Actuators A: Phys, 2006, 126(2):455-462.