體外擴(kuò)增的自體脂肪干細(xì)胞介導(dǎo)自體脂肪移植的臨床研究

湯蘇陽(yáng)，李彥，閆俊靈，陳沖，李梁，丁紅，原理

尋找安全、有效、無(wú)毒、持久的組織代用品是修復(fù)重建外科亟待解決的問(wèn)題。自 20 世紀(jì) 70年代開(kāi)展自體脂肪移植以來(lái)，移植后脂肪的吸收、液化、壞死、感染、纖維囊性化和假性囊腫等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了脂肪移植的發(fā)展。提高脂肪移植成活率、降低脂肪移植后的并發(fā)癥是自體脂肪移植技術(shù)的關(guān)鍵[1]。本研究通過(guò)自體脂肪干細(xì)胞（human adipose stem cells，hADSCs）體外擴(kuò)增混合自體脂肪顆粒移植的方法進(jìn)行面部美容充填和隆胸，6 ～24 個(gè)月后進(jìn)行隨訪研究，比較單純自體脂肪移植與 hADSC 體外擴(kuò)增混合自體脂肪顆粒移植的效果，探討體外擴(kuò)增的 hADSC 是否能提高自體脂肪移植的成活率、降低脂肪移植后并發(fā)癥且有較好的美容成形效果。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與材料

1.1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組納入對(duì)象 50 例，女性46 例，男性 4 例，年齡 23～60 歲，健康狀況良好，無(wú)其他系統(tǒng)性疾病，術(shù)前均簽訂知情同意書(shū)，并經(jīng)武警總醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。實(shí)驗(yàn)于 2010年1月–2012年 1月在本科室完成。

1.1.2 主要試劑和儀器 α-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基、I 型膠原酶和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；小鼠抗人 CD14-PE、CD29-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-FITC 購(gòu)自美國(guó) Biosciences 公司；秋水仙素購(gòu)自上海瑞朗商貿(mào)有限公司；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)購(gòu)自日本 Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 自體脂肪干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng) 患者下腹部抽取 15～20 ml 自體脂肪顆粒，離心 2 次，取脂肪層，加 0.075% I 型膠原酶于 37 ℃ 消化60 min，1500 r/min 離心 15 min，去除上層脂肪組織，沉淀用生理鹽水重懸，70 μm 細(xì)胞篩過(guò)濾，去除殘余結(jié)締組織，再次以 1500 r/min 離心 5 min，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解 5 min，用生理鹽水清洗2 遍，計(jì)數(shù)，用 α-MEM 培養(yǎng)基以 106個(gè)/ml 鋪于培養(yǎng)皿中。記為 P0 代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，0.05% 胰蛋白酶消化，按照 1∶6 的比例傳代。

1.2.2 自體脂肪干細(xì)胞免疫表型鑒定 取第 3 代自體脂肪干細(xì)胞，胰酶消化，PBS 清洗 2 遍，分別標(biāo)記小鼠抗人 CD14-PE、CD29-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-FITC 單抗，對(duì)照管加入小鼠 IgG 抗體，室溫避光孵育 30 min，PBS 清洗 2 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 分化潛能鑒定 取第 3 代自體脂肪干細(xì)胞，加入成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，分別用油紅 O 和 ALP 染色試劑盒鑒定。

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性鑒定 取第 3 代自體脂肪干細(xì)胞，做常規(guī)涂片，Giemsa 染色，油鏡下觀察，分析鑒定[2-3]。

1.2.5 分組情況 實(shí)驗(yàn)組共 50 例，其中隆胸患者 15 例，面部美容充填患者 35 例。二期吸脂方法同一期，吸脂量為 30～450 ml（根據(jù)充填部位的需要），脂肪注射針頭用外徑 3 mm 的不銹鋼針，在皮下和腺體后間隙注入脂肪顆粒和 3～6 代hADSCs 混合物（1 ml 脂肪微?；旌?5×106個(gè)hADSCs）。對(duì)照組病例 10 例，其中隆胸患者4 例，面部美容充填患者 6 例。對(duì)照組為單純自體脂肪移植組，方法與實(shí)驗(yàn)組二期手術(shù)一致，但不加自體脂肪干細(xì)胞，脂肪填充量同實(shí)驗(yàn)組。隆胸患者兩側(cè)乳房分別注入最小量 150 ml，最大量為 450 ml；面部美容充填最小量為 3 ml，最大量20 ml。注射移植部位輕壓包扎固定，供脂肪部位加壓包扎。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs 細(xì)胞形態(tài)觀察

接種后 24 h，倒置顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，成梭形，同時(shí)混有少量未貼壁的圓形淋巴細(xì)胞（圖 1A）；接種 48 h 后，換液將淋巴細(xì)胞去除，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，細(xì)胞呈現(xiàn)旋渦狀生長(zhǎng)（圖 1B）；細(xì)胞傳至第 3 代，未見(jiàn)形態(tài)上有任何差異（圖 1C）。

2.2 hADSCs 免疫表型

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：第 3 代 hADSCs 高表達(dá) CD29、CD44、CD73 和 HLA-ABC，陽(yáng)性率均大于 95%；但不表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物 CD31、CD14，造血細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34、CD45 以及 II 類主要組織相容性抗原 HLA-DR 的陽(yáng)性率低于 3%（圖 2）。

2.3 hADSCs 多向分化及遺傳穩(wěn)定性

第 3 代 hADSCs 在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo) 8 d后，細(xì)胞變圓，油紅 O 染色后顯示細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴生成（圖 3A）；在加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 3 周后，ALP 染色顯示大量成骨細(xì)胞生成（圖 3B）。顯示第 3 代 hADSCs 具有多向分化潛能。染色體分析報(bào)告顯示：第 3 代 hADSCs 細(xì)胞染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)目均未見(jiàn)異常，呈二倍體結(jié)構(gòu)（圖3C），說(shuō)明其核型是穩(wěn)定的。

2.4 患者移植后回訪分析與對(duì)照組比較

對(duì)照組采用單純自體脂肪移植患者 10 例，其中3例出現(xiàn)疼痛、上肢活動(dòng)受限及發(fā)熱等不良反應(yīng)，抗生素使用 7 d，感染得到控制，4 名患者經(jīng)過(guò) 4 次脂肪移植達(dá)到手術(shù)滿意。滿意率 64.2%。實(shí)驗(yàn)組 50 例患者均無(wú)并發(fā)癥出現(xiàn)，抗生素的預(yù)防使用為 3 d，2 名患者經(jīng)過(guò) 2 次以上的脂肪移植，其余患者均為 2次。滿意率 85.7%。圖 4 為隆頦前后的效果對(duì)比圖。圖 5 為隆顴前后的效果對(duì)比圖。圖 6 為隆胸前和隆胸后 12、24 個(gè)月效果對(duì)比圖。外形明顯改變，有較好的美容效果。MRI顯示乳房局部皮下脂肪組織厚度及腺體后脂肪厚度明顯超過(guò)其他周圍組織的皮下脂肪組織厚度，而腺體未見(jiàn)任何病變（圖 7）。

圖2 hADSCs 免疫表型Figure2 The immunophenotype of hADSCs

圖3 分化潛能（A：成脂誘導(dǎo) 8 d；B：成骨誘導(dǎo) 3 周；C：P3 代 hADSCs 細(xì)胞染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)目均未見(jiàn)異常）Figure3 Differentiation potential (A: Adipogenic induction after 8 days; B: Osteogenic induction after 3 weeks; C: Chromosome analysis report showed that morphology, structure and the number of the third generation of hADSCs cells chromosome showed no abnormality)

圖4 隆頦前后的效果（A：移植前；B：移植后）Figure4 Chin augmentation effect (A: Before operation; B:After operation)

圖5 隆顴前后的效果（A：移植前；B：移植后）Figure5 Cheekbones augmentation effect (A: Before operation; B: After operation)

圖6 隆胸前后的效果（A：移植前；B：移植后 12 個(gè)月；C：移植后 24 個(gè)月）Figure6 Breast augmentation effect (A: Before operation; B: 12 months after operation; C: 24 months after operation)

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，具有組織修復(fù)與重建的功能[3]。自 Zuk等[4]2002年成功從脂肪組織分離出干細(xì)胞并命名為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞得到極大關(guān)注，與骨髓來(lái)源的 MSCs 相比，脂肪干細(xì)胞儲(chǔ)量更加豐富，取材更加方便，患者痛苦小，干細(xì)胞擴(kuò)增能力更強(qiáng)，因此脂肪干細(xì)胞是組織工程的理想種子細(xì)胞[5-8]。最近的研究證明，脂肪干細(xì)胞可以向中胚層的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化，也可以向心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝臟細(xì)胞分化，表明了脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能。

圖7 患者術(shù)后 24 個(gè)月乳腺核磁共振檢查顯示患者乳房局部皮下脂肪厚度平均 3.5 cm，胸骨前皮下脂肪組織 1 cm 厚度，腺體組織無(wú)異常Figure7 Breast MRI showed that patients with breast local subcutaneous fat thickness of 3.5 cm on average, anterior chest subcutaneous adipose tissue of 1 cm thickness, gland tissue without exception after 24 months

本研究采用的 hADSCs 介導(dǎo)的自體脂肪移植術(shù)是將具有分化成脂肪細(xì)胞潛能的，且遺傳穩(wěn)定的自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞注射移植進(jìn)行面部塑形和隆胸。研究發(fā)現(xiàn)，其具有提高移植脂肪細(xì)胞的成活率，促進(jìn)移植脂肪的血管再生，減少脂肪顆粒吸收、液化、感染等并發(fā)癥，減少脂肪移植手術(shù)次數(shù)，成形效果好等優(yōu)勢(shì)。分析其原因可能在于：① hADSCs具有分化成脂肪細(xì)胞的能力，注入的 hADSCs單次增加脂肪細(xì)胞的移植數(shù)量約能達(dá) 5×108個(gè)，hADSCs 可以以移植入體內(nèi)的脂肪顆粒細(xì)胞為支架，在其周圍聚積，分化成脂肪細(xì)胞及自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。50 例患者術(shù)后 6 ～24 個(gè)月均無(wú)明顯的外形改變或回縮，外形滿意率為 85.7%。② hADSCs 具有分泌細(xì)胞因子、基質(zhì)的能力，可以促進(jìn)移植脂肪顆粒的血管再生，增強(qiáng)移植的脂肪顆粒細(xì)胞的穩(wěn)定，同時(shí) hADSCs 以脂肪顆粒細(xì)胞為模板進(jìn)行增殖分化。③體外培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪干細(xì)胞單一穩(wěn)定，在移植前脂肪干細(xì)胞再次進(jìn)行免疫表型、遺傳穩(wěn)定、分化潛能的檢測(cè)可以保證移植細(xì)胞的質(zhì)量。④研究證實(shí)每毫升脂肪組織中可得到有核細(xì)胞 1×105～1×107。進(jìn)行移植的hADSCs 數(shù)量取其平均值為 5×106/ml 脂肪顆粒，脂肪顆粒為移植的 hADSCs 起到支架作用，hADSCs 以脂肪顆粒細(xì)胞為模板進(jìn)行增殖分化，可能更符合脂肪組織的生物性狀態(tài)，單純脂肪顆粒移植沒(méi)有 hADSCs 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，出現(xiàn)移植脂肪細(xì)胞的成活率低，脂肪顆粒吸收、液化、感染等并發(fā)癥是毋庸置疑的。

隆胸患者隨訪兩年的 MRI 顯示，hADSCs 介導(dǎo)的自體脂肪移植并沒(méi)有增加腺體的體積，只是增加了乳房局部皮下脂肪組織的厚度，是對(duì)女性乳腺組織安全的隆胸手術(shù)。研究顯示，hADSCs 介導(dǎo)的自體脂肪移植術(shù)具有微創(chuàng)、移植脂肪成活率高、成形效果好等優(yōu)點(diǎn)，是具有發(fā)展前途的、值得推薦的再生醫(yī)學(xué)技術(shù)。

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