腹水型單克隆抗體純化方法的研究

肖增鴻，黃昭亮，林月霞，董斌，田素娟

單克隆抗體被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、臨床疾病的預(yù)防、診斷和治療及畜牧產(chǎn)品違禁限制藥物的檢測(cè)等。其生產(chǎn)方式主要有小鼠體內(nèi)誘生腹水和雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)；前者生產(chǎn)成本低，是目前用于體外應(yīng)用的主要生產(chǎn)方式。但無(wú)論哪種方式生產(chǎn)的單抗，均含有大量的雜蛋白，主要包括白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、α-巨球蛋白、脂類蛋白以及其他宿主蛋白等，不能直接應(yīng)用于體外。因此需對(duì)單抗進(jìn)行后續(xù)的純化，以達(dá)到使用要求。但目前尚沒(méi)有一種方法能滿足不同目的需要，尤其是在規(guī)模化制備單克隆抗體問(wèn)題上顯得更為突出。為了在大規(guī)模單克隆抗體的制備過(guò)程中，盡量減少經(jīng)濟(jì)成本與時(shí)間成本，對(duì)腹水型單抗純化工藝進(jìn)行了探討[1-2]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)、垂直電泳儀由上海天能科技有限公司生產(chǎn)；Moderl 680 酶標(biāo)儀為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品；Ultrospec1100pro 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為美國(guó) Amersham Biosciences 公司產(chǎn)品；核酸蛋白檢測(cè)儀為上海青浦滬西儀器廠產(chǎn)品；小型臺(tái)式記錄儀購(gòu)自上海自動(dòng)化儀表三廠；蛋白 G 親和層析柱和 DEAE 陰離子層析柱為美國(guó)GE 公司產(chǎn)品；Sephadex G-25 由美國(guó) Pharmacia公司生產(chǎn)；4-D10 抗氯霉素單抗（IgG1）腹水由本實(shí)驗(yàn)室制備；辣根過(guò)氧化物標(biāo)記羊抗鼠 IgG 由精美公司分裝；牛血清白蛋白 BSA 由瑞士 Roche公司分裝；硫酸銨、正辛酸等為國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑。

1.2 方法

1.2.1 腹水預(yù)處理 –20 ℃ 保存的原腹水置于4 ℃ 解凍過(guò)夜，取出后 4 ℃ 條件下，10000×g 離心 10 min，取上清，4 ℃ 保存。

1.2.2 兩步硫酸銨沉淀法（AS 法） 取預(yù)處理腹水，用 0.02 mol/L pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液（PB）稀釋 3 倍，再逐滴加入等量 pH 7.0 飽和(NH4)2SO4溶液，使其飽和度達(dá)到 50%，邊加邊攪拌，充分混勻后冰面靜置 30 min。4 ℃ 條件下，10000×g 離心 10 min，取上清，將沉淀于 2 倍原腹水體積的 PB 復(fù)溶，再逐滴加入 8 倍原腹水體積 pH 7.0 飽和硫酸銨，使其飽和度達(dá)到 33%，充分混勻后冰面靜置 30 min。4 ℃，10000×g 離心 10 min。棄上清，將沉淀 4 ℃ 保存。

1.2.3 辛酸-硫酸銨沉淀法（CA-AS 法） 取預(yù)處理腹水，用 0.06 mol/L pH 4.4 醋酸緩沖液稀釋3 倍，用 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 至 4.8；按每毫升稀釋腹水加 11 μl 辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了幔?30 min 內(nèi)加完，4 ℃ 靜置 2 h。取出后，4 ℃ 條件下，15000×g 離心 30 min，取上清，加入 1/10 體積的 0.01 mol/L PBS，用 1 mol/L NaOH 調(diào) pH 至 7.2，在冰面操作加入飽和硫酸銨至 45% 飽和度，靜置 30 min。取出后，10000×g離心 30 min，棄上清，將沉淀 4 ℃ 保存。

表1 不同方法純化后蛋白濃度比較Table1 Comparison of purified protein concentrations by different methods

1.2.4 蛋白 G 親和層析法 將辛酸-硫酸銨法獲得的沉淀以 0.02 mol/L pH 7.0 PB 溶液重溶，過(guò)蛋白 G 親和柱。以 0.1 mol/L pH 2.7 Gly-HCl 為洗脫緩沖液，流速 1 ml/min 洗脫，以 1.0 mol/L pH 9.0 Tris-HCl 為中和緩沖液進(jìn)行接樣收集蛋白。提純樣品保存在 –20 ℃。

1.2.5 DEAE 離子交換層析 將辛酸-硫酸銨法獲得的沉淀以 0.01 mol/L pH 7.2 PB 溶液 A 重溶，經(jīng) Sepharose G-25 除鹽后，過(guò) DEAE 陰離子層析柱。以含 0.5 mol/L NaCl 的 0.01 mol/L pH 7.2 PB 為洗脫液 B，A、B 液混合進(jìn)行線性梯度洗脫，收集蛋白峰。提純樣品保存于 –20 ℃ 環(huán)境中。

1.2.6 蛋白濃度鑒定 采用紫外分光光度計(jì)對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定前用溶解抗體的 PB 溶液調(diào)零，分別測(cè)定 3～4 個(gè)數(shù)值，取其平均值。利用公式：蛋白含量(mg/ml) =（1.45×OD280–0.74×OD260）× 稀釋倍數(shù)。

1.2.7 蛋白分子量鑒定 以還原型 SDS-PAGE進(jìn)行分析，具體方法參照文獻(xiàn)[1]，分離膠濃度為10%。

1.2.8 蛋白純度鑒定 以非還原型 SDS-PAGE進(jìn)行分析，具體方法參照文獻(xiàn)[1]，分離膠濃度為7.5%。

1.2.9 抗體免疫活性鑒定 采用間接 ELISA 法檢測(cè)純化后抗體效價(jià)。以合適濃度的包被抗原CAP-OVA 包被酶標(biāo)板。根據(jù)蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果及SDS-PAGE 鑒定的純度不同，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使純化后 IgG 濃度與原腹水濃度相同。以原腹水按照 1∶1000 稀釋液為陽(yáng)性對(duì)照，SP2/0 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 1∶1000 稀釋腹水為陰性對(duì)照。具體操作方法參照文獻(xiàn)[2]。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體分子量與純度、濃度鑒定

2.1.1 純化前后抗體濃度測(cè)定 不同方法腹水純化前后的蛋白含量見(jiàn)表 1，由此可以看出不同純化方法的收率。

2.1.2 單克隆抗體分子量鑒定 IgG 抗體在 2-巰基乙醇作用下，免疫球蛋白中的二硫鍵被破壞，重鏈與輕鏈分開(kāi)，因此，在還原型 SDS-PAGE 電泳中，可見(jiàn)兩條明顯的條帶，兩者分子量分別為：重鏈約 50 kD，輕鏈約 28 kD，如圖 1 所示。單克隆抗體的分子量為 156 kD。

圖1 單克隆抗體還原型 SDS-PAGE 電泳Figure1 Reduced SDS-PAGE electrophoresis of antibody

2.1.3 單克隆抗體純度鑒定 由于 IgG 抗體由輕鏈與重鏈組成，還原型 SDS-PAGE 電泳很難直觀分析其純度，如圖 2 所示，只能粗略觀察到，CA-AS 法純化后腹水純度略大于兩步 AS 法純化后腹水。利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，CA-AS 法純化后單抗純度可達(dá) 44%，而兩步 AS 法則只能去除含量較大的大分子蛋白條帶，純度約為 25%。

圖2 粗提腹水還原型 SDS-PAGE 電泳Figure2 Reduced SDS-PAGE electrophoresis of the crude sample

為了進(jìn)一步比較單抗純化的效果，采用非還原型 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)了抗體的純度。SDS-PAGE電泳分離膠濃度為 7.5%，然后借助電泳條帶分析軟件進(jìn)行分析，從而精確判斷抗體的純度。利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，可得：蛋白 G 親和層析純化樣品為單一條帶，DEAE 離子交換層析純化樣品還有一些未知大分子殘留，純度 87%（圖 3）。

2.2 單克隆抗體純度、回收率

通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，可得到各種純化方法純化后的 IgG 純度及相應(yīng)的回收率，如表 2 所示。AS 法回收率最高，達(dá)到 63%，但其純度明顯低于 CA-AS 法；蛋白 G親和層析法純度達(dá)到 100%，但其回收率小于10%；DEAE 回收率 11.7%，明顯高于蛋白 G 親和層析法 6.9%，純度 87%。

2.3 純化后抗體間接 ELISA 效價(jià)檢測(cè)

純化后抗體效價(jià)如表 2 所示。將純化前后腹水調(diào)節(jié)至相同濃度，通過(guò)有限稀釋法設(shè)定檢測(cè)梯度，以 OD630為參照，測(cè)定 OD450，以 P/N ≥ 2.1臨界值為最高稀釋倍數(shù)，即相應(yīng)效價(jià)。結(jié)果表明：原腹水效價(jià)為 2.048×106，AS 法和 CA-AS 法純化后抗體活性略低于原腹水；蛋白 G 法純化后效價(jià)為 1.28×105，低于 DEAE 法，抗體活性損失較DEAE 法大。

圖3 非還原型 SDS-PAGE 電泳測(cè)定單克隆抗體純品純度Figure3 SDS-PAGE electrophoresis of samples

3 討論

單克隆抗體在生物檢測(cè)和醫(yī)學(xué)、畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，而其純度與活性是影響其質(zhì)量的關(guān)鍵因素。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室常用的小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b 類單克隆抗體純化方法中，常用沉淀法和層析法。常用粗純的沉淀法有 AS 法、CA-AS 法，一般回收率高，但純度低，活性較好，其中 AS 法收率較高，CA-AS 法純度較高、抗體活性好[2-4]。而經(jīng) AS 法或 CA-AS 法初步純化再聯(lián)合 DEAE陰離子交換層析法或蛋白 A、G 親和層析進(jìn)一步純化，純度可達(dá) 87%～100%[2,5-6]，但回收率較低，CA-AS 法聯(lián)合蛋白 A 親和層析法回收率為26%[5]，AS 法聯(lián)合 DEAE 陰離子交換層析法回收率為 8.9%[2]。本研究分別探討了 AS 法、CA-AS法、CA-AS 法聯(lián)合 DEAE 陰離子交換層析法與CA-AS 法聯(lián)合蛋白 G 親和層析法純化抗氯霉素的 IgG1 類單克隆抗體，AS 法、CA-AS 法的回收率與周玉等[2]、梁榮等[4]的結(jié)果一致，但抗體純度、活性降低，還有待進(jìn)一步研究。CA-AS 法聯(lián)合蛋白 G 親和層析法純化，純度高，但回收率、活性低，成本高。采用 CA-AS 法聯(lián)合 DEAE 陰離子交換層析法，純度比 CA-AS 法聯(lián)合蛋白 G 親和層析法稍低，但顯著提高了回收率與活性，比周玉等[2]報(bào)道的回收率 8.9% 有所提高。綜合考慮，CA-AS 法聯(lián)合 DEAE 陰離子交換層析法，與 AS法、CA-AS 法及 CA-AS 法聯(lián)合蛋白 G 親和層析法相比，無(wú)論在抗體回收率、抗體活性、抗體純度等方面存在較大優(yōu)勢(shì)，且此法操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)使用，生產(chǎn)成本較低，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)試劑盒制備方面，利用此方法純化單克隆抗體，有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表2 不同純化方法純化后蛋白純度、回收率與效價(jià)Table2 Comparison of purity, recovery and antibody titer by different purification methods

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